Die Forschung im Bereich der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) hat seit ihrer Entdeckung im Jahr 2006 einen bedeutenden Fortschritt erlebt. Diese Technologie eröffnet neue Perspektiven für die Behandlung verschiedener Krankheiten. Ein besonderer Fokus liegt dabei auf der effizienten Herstellung von Neuronen aus pluripotenten Stammzellen.
Das Potenzial pluripotenter Stammzellen
Pluripotente Stammzellen, der Ursprung aller vielzelligen Organismen, besitzen die bemerkenswerte Fähigkeit, sich in jeden Zelltyp des Körpers zu differenzieren. Sie sind in der Lage, sich in Zellkulturen unbegrenzt zu replizieren, was ihnen eine Art Unsterblichkeit verleiht. Embryonale Stammzellen (ESC) gelten als der Goldstandard der Pluripotenz. Interessanterweise können auch Körperzellen, wie beispielsweise Hautzellen, zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) umprogrammiert werden, die ähnliche Eigenschaften wie ESC aufweisen.
Dieses Potenzial macht pluripotente Stammzellen zu einer vielversprechenden Quelle für gesunde, differenzierte Zellen in der regenerativen Medizin, insbesondere für die Herstellung von Neuronen. Darüber hinaus bieten diese Zellen wertvolle Einblicke in die menschliche Entwicklung und ermöglichen die Untersuchung von Krankheiten, die Neuronen betreffen, wie Alzheimer, Huntington oder Parkinson.
Herausforderungen bei der neuronalen Differenzierung
Bisherige Methoden zur Herstellung von Neuronen aus Stammzellen waren oft mit hohen Kosten verbunden und führten zu einer Mischung verschiedener neuronaler und anderer Zelltypen. Dies schränkte ihre Anwendbarkeit in Forschung und Therapie ein.
Ein neuer Ansatz: Gezielte Geninaktivierung
Ein Forschungsteam um David Vilchez vom Exzellenzcluster CECAD/Köln hat nun eine innovative Methode entwickelt, um dieses Problem zu lösen. Durch das Ausschalten eines einzigen Gens gelang es ihnen, mit nahezu 100%iger Effizienz Neuronen zu produzieren.
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„Durch das Stilllegen eines Proteins mit der Gentechnik-Methode CRSPR beginnen die Zellen spontan, sich in Neuronen zu verwandeln! Das ist ein hervorragender und viel schnellerer Weg, um die Neurogenese, die Bildung von Nervenzellen, zu verbessern“, so Vilchez. Unter normalen Bedingungen verhindert das Protein CSDE1 die Differenzierung und bewahrt den pluripotenten Status der Zellen.
Diese Entdeckung könnte einen entscheidenden Beitrag zur Herstellung reiner Neuronenpopulationen leisten und das Verständnis neurodegenerativer Erkrankungen verbessern.
Schnelle und effiziente Differenzierung
Hyun Ju Lee, Erstautorin der Studie, zeigte sich beeindruckt von den schnellen Veränderungen in ihren Versuchen: „Wir könnten die Veränderungen visualisieren und wirklich dabei zuschauen, die Differenzierung geht sehr schnell voran. Wir haben auch mehrere Stammzelllinien von verschiedenen Spendern und pluripotente Stammzellen getestet und die gleichen Ergebnisse erzielt." Für die Studie wurden humane embryonale Stammzellen, induzierte pluripotente Stammzellen und Mausstammzellen verwendet.
Anwendungsmöglichkeiten und zukünftige Perspektiven
Der neue Ansatz eröffnet vielversprechende Möglichkeiten für die Erzeugung von Neuronen aus Proben verschiedener Patienten. Diese Neuronen können dann zur Untersuchung zugrundeliegender Krankheiten oder zum Testen von Medikamenten verwendet werden.
Obwohl diese Ergebnisse einen wichtigen Schritt in Richtung klinischer Anwendung darstellen, betont David Vilchez, dass es noch ein weiter Weg ist: „Neue Neuronen aus der Petrischale könnten wichtig sein, um Krankheiten wie Parkinson, Alzheimer oder Huntington zu untersuchen, aber wir sind immer noch am Ausgangspunkt dieser spannenden Forschung."
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Transkriptionsfaktoren und Reprogrammierung
Transkriptionsfaktoren spielen eine entscheidende Rolle bei der Differenzierung von Zellen. Sie können einzelne Gene aktivieren und somit die spezialisierte Identität und Funktion von Zellen im Körper bestimmen. Durch künstliches Einschleusen von Transkriptionsfaktoren in Zellen können Wissenschaftler die Identität von Zellen verändern oder reprogrammieren. So ist es heute bereits möglich, Haut- oder Blutzellen zu Nerven- oder Stammzellen umzuprogrammieren und für die Erforschung von Krankheiten zu nutzen.
Moritz Mall am Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ, HITBR) und Qian Yi Lee an der Stanford Universität verglichen nun zwei Transkriptionsfaktoren, die strukturell ähnlich sind, allerdings völlig unterschiedliche Zelltypen induzieren. Der Faktor Ascl1 kann Hautzellen zu Nervenzellen programmieren, während Myod1 Hautzellen zu Muskelzellen umwandeln kann.
Pionier-Faktoren und Wächter-Faktoren
Die Forscher untersuchten die DNA-Bindestellen beider Faktoren und stellten fest, dass Ascl1 und Myod1 trotz ihrer unterschiedlichen Funktionen an größtenteils überlappenden Erkennungssequenzen im Erbgut der Maus binden. Dies deutete darauf hin, dass weitere Mechanismen an der Regulation der Genexpression beteiligt sein müssen.
Weitere Analysen zeigten, dass Ascl1 und Myod1 an jeweils bestimmten Bereichen im Erbgut mit stärkerer Bindungskraft anheften. Beide Faktoren können auch an sehr kompakte, normalerweise unzugängliche Bereiche des Erbguts binden und dort inaktive Gene einschalten. Transkriptionsfaktoren mit dieser Eigenschaft werden als Pionier-Faktoren bezeichnet.
Ascl1 schaltet bevorzugt Gene ein, die in Nervenzellen benötigt werden, während Myod1 hauptsächlich solche Gene aktiviert, die im Muskel erforderlich sind. Allerdings können beiden Faktoren auch Fehler unterlaufen und unerwünschte Gene einschalten. Sogenannte Wächter-Faktoren können jedoch helfen, diese Fehler zu korrigieren, indem sie gezielt unerwünschte Gene ausschalten.
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Durch den Austausch der DNA-Bindedomäne und Interaktions-Domäne der beiden Faktoren konnten die Forscher den Muskelfaktor Myod1 sogar dazu bringen, Nervenzellen zu induzieren. Dies zeigt, dass die Bindung an die DNA und an die Ko-Faktoren gemeinsam die Spezifizität der Pionier-Faktoren bestimmen.
Bedeutung für die Krankheitsforschung
Die neuen Erkenntnisse über die Funktionsweise von Pionier- und Wächter-Faktoren könnten genutzt werden, um noch präziser bestimmte Zelltypen für die Forschung zu erzeugen. Dies könnte in Zukunft möglicherweise die Untersuchung von Gehirnerkrankungen in der Kulturschale ermöglichen.
Mutationen in Wächterfaktoren stehen mit Erkrankungen wie Krebs in Verbindung, was ihre bedeutende Rolle unterstreicht.
Altersbedingte Alzheimerforschung mit iN-Zellen
Ein weiterer vielversprechender Ansatz zur Untersuchung von Krankheiten mithilfe von neuronaler Differenzierung ist die Verwendung von induzierten Nervenzellen (iN). Im Gegensatz zu iPS-Zellen behalten iN-Zellen das epigenetische Alter der Spenderzellen bei.
Jerome Mertens von der Universität Innsbruck und sein Team konnten zeigen, dass die altersbedingte Form von Alzheimer mit dem Alter zu tun haben muss. Sie verglichen Hautzellen von Alzheimer-Erkrankten mit einer Kontrollgruppe gesunder Menschen ähnlichen Alters und stellten fest, dass die verjüngten Spenderzellen der Alzheimer-Erkrankten, die mittels iPS-Methode hergestellt wurden, nahezu keine Hinweise auf eine spätere Erkrankung zeigten. Im Gegensatz dazu zeigten die "alten Nervenzellen", die Dank der iN-Methode das epigenetische Alter beibehalten hatten, deutliche Unterschiede zwischen den Zellen der Erkrankten und denen der Kontrollgruppe.
Gemeinsamkeiten zwischen Alzheimer und Krebs
Die Forscher fanden auch heraus, dass die Nervenzellen der Alzheimer-Erkrankten ihre reife Identität verloren haben und Ähnlichkeiten mit ‚unfertigen’ Nervenzellen zeigen. Dieser Verlust von Merkmalen der Zelldifferenzierung weist Ähnlichkeiten zu Krebszellen auf.
Die Analysen zeigten in den kranken Nervenzellen eine deutliche Herunterregulierung von reifen neuronalen Eigenschaften und eine Hochregulierung von unreifen Signalwegen. Vor allem in der Gruppe der Signalwege, die bei den Erkrankten im Vergleich zur Kontrollgruppe hochreguliert waren, gab es eine enorme Ähnlichkeit zu aus der Krebsforschung bekannten Daten.
Direkte Reprogrammierung durch ASCL1
Die Ursachen vieler neurologischer Erkrankungen, wie beispielsweise von Autismus oder Schizophrenie, sind kaum bekannt. Ein großes Hindernis bei der funktionellen Untersuchung dieser Krankheiten ist der begrenzte Zugang zu menschlichen Nervenzellen. Daher stellt die Entdeckung, dass durch Überexpression von neuronalen Transkriptionsfaktoren verschiedenen Zelltypen zu induzierten neuronalen Zellen umgewandelt werden können, eine faszinierende Methode dar, um neurobiologische Erkrankungen zu untersuchen und auch behandeln zu können.
Arbeiten aus unserem Labor haben gezeigt, dass der Pionier Transkriptionsfaktor Ascl1 bei der direkten Reprogrammierung von Bindegewebszellen zu Nervenzellen bestimmte Nervenzell- Gene anschalten kann.
Die Rolle von Myt1l bei der Aufrechterhaltung der neuronalen Identität
Meine Arbeit zeigt, das gezieltes ausschalten unerwünschter Gene eine ebenso entscheidende Rolle in diesem Umwandlungsprozess spielt. Der molekulare Repressor Myt1l der wie Ascl1 für die effiziente Reprogrammierung benötigt wird, bindet und inaktiviert nämlich viele Gene während der Nervenzellinduktion. Etliche dieser Gene haben primär nichts mit Nervenzellfunktionen zu tun, sondern sind typisch für andere Zelltypen wie Bindegewebe, Knorpel-, Herz- und Lungenzellen.
Myt1l funktioniert daher wie ein molekularer Wächter, der bewirkt, dass eine Zelle während der Reprogrammierung zu einer Nervenzelle nicht gleichzeitig versucht eine Bindegewebszelle zu bleiben oder ein anderer Zelltyp zu werden. Erstaunlicherweise verbessert Myt1l auch die Differenzierung von Neuronen aus natürliche Nervenvorläuferzellen in Zellkultur. Inaktiviert man Myt1l akut in Gehirnzellen von Mäuse-Embryonen, differenzieren diese nicht mehr effizient zu Nervenzellen. Myt1l ist daher auch bei der normalen Differenzierung von Nervenzellen wichtig.
Interessanterweise ist Myt1l einer der wenigen Transkriptionsfaktoren die dauerhaft in Nervenzellen aktiv sind. Schaltet man Myt1l in bereits entwickelten Nervenzellen von neugeborenen Mäuse aus, verlieren diese Zellen nicht nur Geneexpressionsmuster und funktionelle Eigenschaften von Nervenzellen, sondern aktivieren auch Gene, die ansonsten nur in Herz- oder Hautzellen exprimiert sind.
Da Mutationen in Myt1l mit neuropsychologischen Erkrankungen wie Autismus und Schizophrenie in Verbindung stehen, ist es möglich dass diese Erkrankungen aus einer „Identitätskrise“ der Nervenzellen hervorgehen. Meine Forschungsergebnisse zeigen erstmals wie wichtig die dauerhafte Repression von unerwünschten genetischen Programmen für die Entwicklung und Erhaltung von Nervenzellidentität ist. Dies könnte neue Wegen eröffnen, um Erkrankungen wie Autismus oder Schizophrenie besser zu verstehen und zu behandeln. Myt1l spielt dabei eine einzigartige Rolle, indem es etliche Nicht-Nervenzellprogramme ausschaltet. Der repressive Wächter Myt1l agiert daher als perfektes Gegenstück zu aktivierenden Transkriptionsfaktoren wie beispielsweise Ascl1, um gemeinsam Nervenzellen wirksam und zum richtigen Zeitpunkt zu generieren.
Innervierte Hautmodelle
In aktuellen Studien konnte gezeigt werden, dass die sensorischen Neurone der Haut in engem Kontakt zu Keratinozyten und anderen Hautzellen stehen und so eine wichtige Rolle in der Schmerzempfindung, bei Entzündungen und sensitivierenden Reaktionen in der Haut spielen.
Um auch die Beteiligung sensorischer Neurone in der Reaktion auf hautsensitivierende Substanzen in vitro beurteilen zu können, sollte in der vorliegenden Arbeit ein innerviertes Vollhautmodell aufgebaut werden, um das Einwachsen sensorischer Neuronen in die oberen Hautschichten abbilden zu können. Die darin verwendeten sensorischen Neurone und Schwann-Zellen wurden aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen differenziert.
Die dreidimensionalen Kollagen- und Fibrinmodelle haben in diesem Projekt keine Epidermis ausgeprägt und es konnte keine Innervation dargestellt werden. Entsprechend konnte das Neuritenwachstum nicht in Abhängigkeit von einer sensitivierenden Substanz dargestellt werden. Es müssten also zunächst die Modelle optimiert werden, zum Beispiel über die Verwendung einer dünneren Matrix bei den Kollagenmodellen und die Zugabe von Schwann-Zellen zu den Fibrinmodellen.
Die Umprogrammierung von Zellen: Ein Paradigmenwechsel
Die "Umprogrammierung" von Zellen, auch Transdifferenzierung genannt, spielt eine immer größere Rolle in der Stammzellforschung. Dabei wird eine beliebige Zellsorte im Labor in eine andere verwandelt. Hautzellen werden zu Nervenzellen, Leber- zu Herzzellen und so weiter.
Erstmals gelang dies vor einigen Jahren dem aus Österreich stammenden Stammzellenforscher Marius Wernig von der Stanford-Universität, der aus Hautzellen einer Maus funktionsfähige Nervenzellen, sogenannte Neurone, machte.
Grenzen und zukünftige Herausforderungen
Die Umprogrammierung von Zellen ist jedoch noch auf das Labor beschränkt. Im Körper von Maus oder Mensch wurde die Umprogrammierung noch nicht ausprobiert.
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