Einführung
Plasmazytoide dendritische Zellen (PDCs) stellen eine spezialisierte Untergruppe dendritischer Zellen dar, die eine entscheidende Rolle bei der Verbindung des angeborenen und adaptiven Immunsystems spielen. Sie sind vor allem für ihre Fähigkeit bekannt, große Mengen an Typ-I-Interferon (IFN-I) als Reaktion auf virale oder bakterielle Infektionen zu produzieren. Dies macht sie zu wichtigen Akteuren bei der Abwehr von Krankheitserregern und der Modulation von Immunantworten. Trotz ihrer Bedeutung sind viele Aspekte ihrer genauen Funktion und Regulation noch nicht vollständig geklärt. Dieser Artikel bietet einen umfassenden Überblick über die Funktion von PDCs, einschließlich ihrer Rolle bei der Immunüberwachung, der Antigenpräsentation und der Immunmodulation unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen.
PDCs als Hauptproduzenten von Typ-I-Interferon
PDCs sind die Hauptproduzenten von Typ-I-Interferonen (IFN-I) als Reaktion auf mikrobielle Reize. Diese Interferone spielen eine entscheidende Rolle bei der antiviralen Immunität, indem sie die Expression antiviraler Gene induzieren und die Aktivität von Immunzellen wie natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und T-Zellen steigern. Die Produktion von IFN-I durch PDCs wird durch die Aktivierung von Toll-like-Rezeptoren (TLRs) ausgelöst, insbesondere TLR7 und TLR9, die intrazellulär lokalisiert sind und virale Nukleinsäuren erkennen.
Die Fähigkeit von PDCs, große Mengen an IFN-I zu produzieren, macht sie zu wichtigen Akteuren bei der frühen Immunabwehr gegen Virusinfektionen. Studien haben gezeigt, dass PDCs eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle von Virusinfektionen wie Influenza, Herpes simplex und HIV spielen. Darüber hinaus sind PDCs an der Pathogenese verschiedener Autoimmunerkrankungen beteiligt, bei denen eine übermäßige IFN-I-Produktion zur Entstehung von Entzündungen und Gewebeschäden beiträgt.
Expression von CD303 und seine Rolle bei der Regulation der IFN-α-Produktion
CD303 ist ein transmembranes Glykoprotein, das zur Dectin-2-Familie der Typ-II-Calcium-abhängigen C-Typ-Lektine gehört und spezifisch auf humanen plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDCs) exprimiert wird. CD303 interagiert mit der FcεRγ-Kette, wodurch es Funktionen eines Signalrezeptors ausübt. Die Bindung eines CD303-spezifischen Antikörpers induziert ein B-Zell-ähnliches Signalosom, welches zur Inhibition der Interferon-α (IFN-α)-Produktion in humanen PDCs führt. Eine unkontrollierte IFN-α-Ausschüttung wird in vielen Autoimmunerkrankungen wie systemischer Lupus erythematodes (SLE) oder Psoriasis als hauptsächlicher pathophysiologischer Faktor angesehen. Die Inhibition der IFN-α-Sekretion kann in diesem Zusammenhang ein wichtiges therapeutisches Mittel gegen Autoimmunerkrankungen sein.
Der natürliche Ligand von CD303 (CD303L) ist unbekannt, und das Anvisieren dieser Ligand-Rezeptor-Interaktion könnte eine erfolgreiche therapeutische Strategie gegen viele Autoimmunerkrankungen wie systemischen Lupus erythematodes und Psoriasis sein, bei denen IFN-α als der wichtigste pathophysiologische Faktor angesehen wird. Die Isolierung und Charakterisierung eines endogenen CD303L könnte weitere Einblicke in die Regulation von CD303 und die Funktion von PDCs bei Autoimmunität geben, und dies war das Ziel des ersten Teils des Projekts.
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Obwohl viele CD303L+ Zelllinien (hauptsächlich Krebszelllinien) und primäre Zellen (Monozyten und B-Zellen) identifiziert wurden, schlug die Isolierung eines CD303L fehl. Außerdem wurden keine funktionellen Eigenschaften von CD303L beobachtet, die auf der Zelloberfläche von CD303L+ Zellen exprimiert wurden. Dennoch wurde eine Kalzium-abhängige Ligand-Rezeptor-Interaktion bestätigt, die unabhängig von den Kohlenhydratresten auf rCD303 selbst war. Schließlich identifizierten Riboldi und Kollegen CD303 als einen Rezeptor für terminale Asialo-Galactosyl-Oligosaccharide.
Sca-1 als Marker für unterschiedliche Entwicklungsstadien von PDCs
Der Stammzellmarker Sca-1 (stem cell antigen-1) wurde als ein Marker, der differentiell in murinen PDCs exprimiert wird, identifiziert. Eine funktionelle Analyse der Sca-1+ und Sca-1- Subpopulationen war das Ziel des zweiten Projektes dieser Arbeit. Es konnte bestätigt werden, dass die Sca-1-Expression unterschiedliche Entwicklungsstadien von PDCs definiert. Sca-1- PDCs zeigten dabei einen Vorläufer-Phänotyp. Sie wiesen eine erhöhte Proliferationsaktivität auf und residierten primär im Knochenmark, während Sca-1+ PDCs durch eine verstärkte Expression von MHC-II-Molekülen eher einen reiferen Phänotyp repräsentierten und mit hohen Frequenzen in den Lymphknoten zu finden waren. Repopulationsuntersuchungen in der CD303-Diphtherietoxin-Rezeptor transgenen Maus, in der durch die Zugabe von Diphterietoxin alle endogenen PDCs depletiert werden konnten, zeigten, dass sich zuerst Sca-1- PDCs und nachfolgend Sca-1+ PDCs entwickelten. Die Regulation der Sca-1-Expression erfolgte dabei durch lokale Faktoren des Mikromilieus des jeweiligen Organs. Die Sca-1-Expression konnte durch eine TLR7/9-abhängige Aktivierung der Zellen induziert werden. Die Stimulation mit dem endosomalen TLR9-Liganden CpG-A zeigte eine Heterogenität der Zellen in ihrer Fähigkeit zur IFN-α-Produktion. Sca-1+ PDCs produzierten geringe Mengen an IFN-α verglichen mit Sca-1- Zellen, die folglich als die wahren natürlichen IFN-α-Produzenten identifiziert wurden. Interessanterweise war diese Diskrepanz nach lysosomaler TLR9-Stimulation der Zellen mit CpG-B in der Produktion proinflammatorischer Zytokine nicht detektierbar. Um die molekularen Mechanismen, die zur funktionellen Heterogenität der Sca-1-Subpopulationen nach endosomaler, aber nicht lysosomaler TLR9-Stimulation führten, zu ermitteln, wurden Microarray-Analysen mit sortierten Sca-1+ und Sca-1- PDCs durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Osteopontin (Opn) stark in Sca-1- PDCs hochreguliert war.
PDCs in der Nasenschleimhaut
Die Rolle von plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDC), den Hauptproduzenten von Alpha-Interferon nach einer Virusinfektion, in der Nasenschleimhaut ist weitgehend unbekannt. Hier wurde die Anwesenheit von PDC zusammen mit myeloiden dendritischen Zellen (MDC) im Nasenepithel von gesunden Personen, von asymptomatischen Patienten mit chronischer Nasenallergie, von Patienten unter Steroidtherapie und von Patienten mit infektiöser Rhinitis oder Rhinosinusitis untersucht. Es konnte eine beträchtliche Anzahl von PDC und MDC im Nasenepithel nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde die Expression von SDF-1, dem wichtigsten Chemoattraktanten für PDC, im Nasenepithel nachgewiesen. Die PDC-Werte waren bei Patienten mit Allergien signifikant niedriger als bei gesunden Personen. Interessanterweise waren PDC und MDC bei Patienten, die mit Glukokortikoiden behandelt wurden, fast nicht vorhanden, während bei Patienten mit kürzlichen Infektionen der oberen Atemwege sehr hohe Anzahlen von PDC gefunden wurden. Diese Ergebnisse zeigen erstmals eine quantitative Analyse von PDC und MDC im gesunden Nasenepithel und im Nasenepithel von Patienten mit verschiedenen pathologischen Zuständen.
PDCs als Antigen-präsentierende Zellen
Neben ihrer Rolle als IFN-I-Produzenten können PDCs auch als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) fungieren und T-Zellen aktivieren. Sie exprimieren MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Moleküle, die Antigene präsentieren und T-Zell-Rezeptoren aktivieren können. Die Fähigkeit von PDCs, T-Zellen zu aktivieren, ist jedoch im Vergleich zu anderen APCs wie konventionellen DCs relativ gering.
Die Rolle von PDCs bei der Antigenpräsentation wird kontrovers diskutiert. Einige Studien haben gezeigt, dass PDCs in der Lage sind, naive T-Zellen zu aktivieren und Immunantworten auszulösen, während andere Studien darauf hindeuten, dass PDCs eher an der Induktion von Toleranz beteiligt sind. Es ist wahrscheinlich, dass die Funktion von PDCs als APCs von verschiedenen Faktoren abhängt, wie z. B. dem Reifegrad der PDCs, der Art des präsentierten Antigens und dem Vorhandensein von Co-stimulatorischen Signalen.
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mPDCA-1 als spezifischer Marker für PDCs
In der Forschung wurden verschiedene monoklonale Antikörper generiert, die alle ein Oberflächenantigen erkannten, das spezifisch auf PDCs in naiven Mäusen exprimiert war und das als "murines PDC Antigen 1" (mPDCA-1) bezeichnet wurde. Mithilfe differentieller Genexpressionsanalyse konnte gezeigt werden, dass die anti-mPDCA-1 Antikörper das "Bone marrow stromal antigen 2" (BST2) erkennen. Weitere Experimente zeigten, dass Ligation des mPDCA-1 Rezeptors eine Toll-like Rezeptor-induzierte Produktion von Typ I Interferonen in PDCs inhibierte. Die Kreuzvernetzung des Rezeptors mit anti-mPDCA-1 Antikörpern resultierte in einer intrazellulären Kalzium-Mobilisierung sowie in einer allgemeinen Phosphorylierung von Proteintyrosinresten. Des Weiteren führte die Kreuzvernetzung sowohl in vitro als auch in vivo zu einer schnellen und effizienten Internalisierung des Rezeptor-Antikörperkomplexes.
Als nächstes wurde die potentielle Funktion des mPDCA-1 Moleküls als PDC-spezifischer Antigen-Aufnahmerezeptor untersucht. Da die Applikation des vollständigen anti-mPDCA-1 Antikörpers in vivo in Fc-vermittelter oder ADCC-abhängiger Depletion der PDCs resultierte, wurde Ovalbuminprotein kovalent an ein nichtdepletierendes F(ab')2-Fragment des anti-PDCA-1 Antikörpers konjugiert. Somit konnten PDCs spezifisch in vitro und in vivo angefärbt werden. Über mPDCA-1 aufgenommenes Antigen wurde prozessierte und auf Klasse I und II MHC-Molekülen präsentiert. Dabei waren PDCs in der Lage, naïve CD4+ and CD8+ T-Lymphozyten in vitro effizient zu primen. Sowohl das Priming als auch das cross-priming antigenspezifischer T-Zellen war abhängig von einer Aktivierung der PDCs, die mit einer verstärkten Expression costimulatorischer und MHC-Moleküle einherging. Dieser zusätzliche Stimulus schien auch die Antigenprozessierungs- und präsentationsmaschinerie zu aktivieren. Zusammengefasst ist mPDCA-1 ein spezifischer Marker für die Identifizierung von PDCs.
PDCs und Blastische Plasmazytoide Dendritische Zellneoplasie (BPDCN)
Die blastische plasmazytoide dendritische Zellneoplasie (BPDCN) ist eine sehr seltene und meist aggressiv verlaufende hämatologische Neoplasie unreifer Vorläufer plasmazytoider dendritischer Zellen mit myeloischer und lymphatischer Prägung. Den mehrfachen Revisionen der Terminologie der Erkrankung (z.B. vormals Blastisches NK-Zell Lymphom) liegen Kontroversen zur Ursprungszelle und bzgl. ihrer Einordung in Klassifikationsschemata zugrunde. Die BPDCN tritt überwiegend bei älteren Erwachsenen und nur selten bei Kindern auf. Kutane singuläre oder multilokuläre, oft kontusiforme Läsionen stellen die häufigste Initialmanifestation dar. Meist liegt jedoch bereits zu diesem Zeitpunkt oder wenig später eine rasch progrediente systemische Ausbreitung mit Krankheitsmanifestation in Knochenmark, peripherem Blut und Lymphknoten vor. Unbehandelt führt die BPDCN in kurzer Zeit zum Tod. Mit mittleren Gesamtüberlebenszeiten von <2 Jahren sind die therapeutischen Ergebnisse in der BPDCN bisher sehr unbefriedigend. Längerfristige Krankheitskontrollen werden lediglich mit einer konsolidierenden Stammzelltransplantation erreicht. Hoffnungsträger sind neue zielgerichtete Therapieansätze.
Wegweisend in der Diagnostik ist der charakteristische Immunphänotyp der Tumorzellen mit Expression von CD123, CD4, CD56 bei Abwesenheit von pan-T, pan-B und myeloischen Markern. Die Sicherung der Diagnose erfolgt durch den charakteristischen Immunphänotyp anhand der Immunhistochemie und/oder der Durchflusszytometrie des Haut- und Knochenmarkbiopsates (-aspirates) bzw. der sonstigen betroffenen Gewebe. Das in der Regel zytomorphologisch monomorph blastär imponierende Infiltrat zeigt folgenden Immunphänotyp: Expression von mindestens vier der folgenden fünf Marker*: CD123 (≈95%), CD4 (≈95%), CD56 (≈95%), TCL1 (≈90%), BDCA2 (≈90%).
PDCs und Granzym B
PDCs sind entscheidende Vermittler von angeborenen und adaptiven Immunantworten. Ein besseres Verständnis der PDC-Regulation kann immuntherapeutische Ansätze bei Krebs, Infektionskrankheiten und Autoimmunität verbessern. Abgesehen von der Produktion von IFN-alpha und TNF-alpha wurde gezeigt, dass PDC große Mengen der Serinprotease Granzym B (GrB), aber kein Perforin, sezernieren können. In den letzten Jahren wurde die Regulation von GrB in PDC auf der Grundlage der Erkenntnis untersucht, dass PDC-GrB die T-Zellproliferation wirksam unterdrückt. Während die Zytokine IL-3 und IL-10 eine Schlüsselrolle für die GrB-Induktion spielten, hemmen Toll-like-Rezeptor-Agonisten und CD40-Ligand die GrB-Sekretion. Um die physiologische Funktion von PDC-GrB zu charakterisieren, wurde die Wirkung von häufig verwendeten antiviralen Impfstoffen auf PDC untersucht und festgestellt, dass insbesondere der FSME-Impfstoff nicht nur eine deutliche IFN-alpha-Sekretion induzieren, sondern auch das von PDC stammende GrB effizient unterdrücken konnte, was eine effiziente T-Zell-Antwort ermöglichte. PDC von gesunden Personen nach einer FSME-Impfung produzierten weniger GrB als vor der Impfung, ein Mechanismus, der möglicherweise zu einer erfolgreichen zellulären Immunantwort auf den Impfstoff beiträgt.
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Die Daten weisen auf eine mögliche Beteiligung von GrB-sezernierenden PDC an der Unterdrückung tumorspezifischer T-Zellen hin und legen nahe, dass PDC eine regulatorische Rolle spielen können, die durch GrB in Abwesenheit von Perforin vermittelt wird; ein Mechanismus, der auch für regulatorische T-Zellen beschrieben wurde. Da IL-3 und IL-10 auch in der Umgebung von malignen Geweben vorkommen können, kann PDC-GrB an der Unterdrückung tumorspezifischer T-Zellen beteiligt sein. Interessanterweise wurde FSME in einer Tumorimpfungsstudie als natürlicher Agonist verwendet, und es wird angenommen, dass die Unterdrückung von GrB zu dem beobachteten Anti-Tumor-Effekt beigetragen hat.
PDCs in Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinomen (HNSCC)
Humane plasmazytoide dendritische Zellen (PDCs) sind in solidem Tumorgewebe und metastatischen zervikalen Lymphknoten (CLN) bei Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinomen (HNSCC) vorhanden. Es wurde kürzlich gezeigt, dass klassische PDC-Funktionen in der Tumormikroumgebung stark gestört sind. In dieser Studie wird ein neuer Ansatz für das Thema vorgestellt, indem 3 PDC-Subgruppen in HNSCC eingeführt werden, die durch die Oberflächenmarker CD25, CD56 und CD203c gekennzeichnet sind. Die erste Subgruppe, die positiv für CD25 ist, wird durch HNSCC in vitro signifikant induziert und ist in vivo in metastatischen Lymphknoten vorhanden. Diese Subgruppe kann phänotypisch in gereifte Zellen und in eine Gruppe unterteilt werden, die frühe T-Zell-Marker exprimiert. Funktionell ist diese Subgruppe mit der Sekretion von IL-8 verbunden. Die zweite Subgruppe, die positiv für CD56 ist, macht 4-5 % aller PDCs aus und wird durch HNSCC signifikant herunterreguliert. Darüber hinaus exprimiert diese Population sporadisch Perforin/Granzym B und ist in metastatischen Lymphknoten nicht vorhanden. Die dritte Subgruppe, die positiv für den basophilen Marker CD203c ist, ist durch die Vernetzung von BDCA-2 in Gegenwart von HNSCC und IL-4 induzierbar.
Der Einfluss von Transforming Growth Factor-β1 auf die Entwicklung und Subtypspezifizierung dendritischer Zellen
Die molekularen Mechanismen, die die Entwicklung von CDP aus hämatopoetischen Stammzellen und die CDP Spezifizierung in die DC Subtypen cDC und pDC bestimmen, blieben jedoch weiterhin unklar. Dies liegt zum Teil am Fehlen genetischer Systeme und/oder Zellkulturmodellen, die es erlauben würden, die Auswirkung einzelner Faktoren (wie z. B. von Transkriptionsfaktoren und Zytokinen) auf die verschiedenen Stadien der DC Entwicklung zu untersuchen. In der Forschung wurde ein Kultursystem etabliert, das die Entwicklung von CDP aus hämatopoetischen Stammzellen unter definierten Bedingungen in vitro nachvollzieht. Desweiteren wurden die molekularen Mechanismen analysiert, die zur Spezifizierung von CDP in cDC und pDC führen. Die in vitro amplifizierten CDP können Funktion, Oberflächenmarker- und Genexpressionsprofile der in vivo CDP nachvollziehen und liefern damit ein wertvolles Modellsystem zur Erforschung der molekularen Mechanismen der DC Entwicklung.
In dieser Arbeit wurde dann die Bedeutung von transforming growth factor-b1 (TGF-b1) für die CDP Differenzierung und die DC Subtypspezifizierung untersucht. TGF-b1 ist ein multifunktionelles Zytokin mit einer fundamentalen Bedeutung für DC. In genomweiten Genexpressionsanalysen konnte gezeigt werden, dass das Transkriptionsprofil von CDP durch TGF-b1 innerhalb von 24 Stunden in Richtung eines DC-spezifischen Profils verschoben wird. Damit beschleunigt TGF-b1 die Differenzierung von CDP in DC. Dies geht einher mit (i) der Hochregulierung von Genen mit einer Bedeutung bei der DC Differenzierung und/oder Funktion und (ii) der Herunterregulierung von proliferationsassoziierten Genen. Auch wurde beobachtet, dass TGF-b1 die Subtypspezifizierung in Richtung cDC beeinflusst. Nach Behandlung mit TGF-b1 erwerben CDP ein cDC-spezifisches Transkriptionsfaktorrepertoire, z. B. die Induktion des Transkriptionsfaktors interferon regulatory factor-4 (IRF-4) und mehrere Mitglieder der nuclear factor-kB (NF-kB) Transkriptionsfaktoren, die dann die cDC Differenzierung einleiten. Gleichzeitig induziert TGF-b1 Transkriptionsfaktoren, wie z. B. inhibitor of DNA binding/differentiation 2 (Id2) und interferon regulatory factor-1 (IRF-1), die die pDC Differenzierung blockieren.