Einführung
Fusobacterium nucleatum, ein in der Mundhöhle vorkommender Keim, ist ein wichtiger Bestandteil der gesunden Mundflora. Es ist jedoch auch bekannt dafür, das Wachstum menschlicher Karzinome, etwa im Darm oder in der Brust, zu beschleunigen. Neue Forschungsergebnisse deuten auf einen Zusammenhang zwischen diesem Bakterium und potenziellen Hirndurchblutungsstörungen hin, was die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen unterstreicht.
Die Rolle von Fusobacterium nucleatum bei Krebserkrankungen
Fusobacterium nucleatum wird zunehmend auch innerhalb des menschlichen Körpers, nämlich auf Darmkrebszellen und Mammakarzinomen nachgewiesen. Dort scheint er das Tumorwachstum zu befördern und die Behandlung zu erschweren. Wissenschaftler:innen vom Helmholtz-Institut für RNA-basierte Infektionsforschung (HIRI) in Würzburg und des Instituts für Molekulare Infektionsbiologie (IMIB) der Julius-Maximilians-Universität Würzburg (JMU) haben für fünf klinisch relevante Stämme des Keims einen globalen Atlas der RNAs, also der Ribonukleinsäuren (von engl. ribonucleic acid) erstellt. Damit können sie hunderte zuvor unbekannte Ereignisse in der Genregulation der Mikroorganismen nachweisen und zeigen, wie sich diese im Laufe des Bakterienwachstums verändern. Außerdem haben die Forscher:innen erstmals einen Überexpressions-Vektor als genetisches Werkzeug im Fusobacterium eingesetzt, um die Funktionen seines Erbguts zu untersuchen.
Jörg Vogel, HIRI-Direktor und Professor des IMIB, meint, dass der RNA-basierte Ansatz völlig neue Möglichkeiten eröffnet, einen klinisch überaus relevanten Mikroorganismus auf molekularbiologischer Ebene zu analysieren und besser zu verstehen. Er ist zuversichtlich, dass die vorliegenden Erkenntnisse die weiterführende translationale, also auf die medizinische Anwendung zielende Forschung befördern werden.
Die durchgeführte RNA-Kartierung umfasst Fusobacterium nucleatum mit seinen Unterarten nucleatum, animalis, polymorphum und vincentii sowie Fusobacterium periodonticum. Die Wissenschaftler:innen haben die primären Transkriptome - die Gesamtheit der RNA-Moleküle - dieser Stämme erfasst. Um deren genetische Funktionen zu untersuchen, setzte das Team einen Überexpressions-Vektor ein. Das ist gewissermaßen ein Werkzeug, das ein bestimmtes Gen dauerhaft „anschalten“ kann, um dessen Wirkweise genau zu analysieren.
Die Forscher:innen entdeckten durch Einsatz des Überexpressions-Vektors kleine regulatorische RNAs, sogenannte sRNAs (von engl. small RNAs), und konnten erstmals nachweisen, dass diese auch eine regulatorische Funktion in den Mikroorganismen erfüllen. Eine durchaus interessante Beobachtung, wie Falk Ponath, Erstautor der Studie, meint: „Fusobacterium nucleatum hat sich in seiner evolutionsbiologischen Entwicklung recht früh von anderen Bakterien entfernt. Deswegen sind wir nicht von vornherein davon ausgegangen, in den untersuchten Stämmen sRNA zu entdecken, die ähnlich agiert wie bereits bekannte in anderen Bakterien.“ Und nicht nur das: Das Team konnte ebenso nachweisen, dass diese kleine RNA ein Protein der äußeren Zellmembran reguliert.
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Die Studienergebnisse untermauerten außerdem die Anpassungsfähigkeit des Keims und könnten zumindest in Teilen erklären, warum dieser als Generalist auftrete, so Ponath. „Der opportunistische Erfolg von Fusobacterium nucleatum im Krebsgewebe ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass diejenigen Gene stets aktiv sind, die für die Adhäsion an die Tumorzellen verantwortlich sind“, sagt der Wissenschaftler.
Neue genetische Werkzeuge zur Erforschung von Fusobakterien
Wissenschaftler:innen des Helmholtz-Instituts für RNA-basierte Infektionsforschung (HIRI) und des Instituts für Molekulare Infektionsbiologie (IMIB) in Würzburg wollen besser verstehen, wie genau der Mundhöhlenkeim Fusobacterium nucleatum mit verschiedenen Krebserkrankungen in Verbindung steht. Um den molekularen Strategien dieser Bakterien auf die Schliche zu kommen, hat das Team neue genetische Werkzeuge entwickelt. Entdeckt wurde damit ein möglicher Regulator für das Anhaften der Mikroorganismen an Tumorzellen. Die Erkenntnisse dienen der Suche nach neuen therapeutischen Angriffspunkten und wurden kürzlich in dem Fachmagazin PNAS (The Proceedings of the National Academy of Sciences) veröffentlicht.
Mehr als 4.500 Bakterienarten besiedeln den Menschen. Obwohl ihre Bedeutung für Wohlbefinden und Gesundheit ebenso wie für Erkrankungen zunehmend erkannt wird, sind die zugrunde liegenden molekularbiologischen Zusammenhänge großteils noch unbekannt. Das gilt auch für Fusobakterien: Sie sind häufig in der Mundflora anzutreffen, können jedoch auch andere Stellen des menschlichen Körpers besiedeln, insbesondere Krebsgewebe. Dort fördern sie Tumorwachstum und Metastasen, erschweren die Behandlung und verschlechtern die Prognose. Diese Verbindung ist bereits vielfach bei Darm- und Brustkrebs nachgewiesen worden. Darüber hinaus stehen Fusobakterien zunehmend in Verdacht, auch bei Krebserkrankungen anderer Organe, etwa der Speiseröhre und Bauchspeicheldrüse, eine entsprechende Rolle zu spielen.
Doch wie gelingt es dem Mundhöhlenkeim, sich derart anzupassen, dass er auch außerhalb seines ursprünglichen Habitats überleben kann? Dies zu entschlüsseln, kann neue therapeutische Ansätze im Kampf gegen Krebs hervorbringen - und steht deshalb im Fokus der Forschung von Jörg Vogel, Geschäftsführender Direktor des Helmholtz-Instituts für RNA-basierte Infektionsforschung (HIRI) in Würzburg und korrespondierender Autor der vorliegenden Studie.
„Fusobakterien sind klinisch höchst relevant, aber selbst noch wenig erforscht“, stellt Jörg Vogel fest. „Ein Ziel meiner Arbeitsgruppen am HIRI und IMIB ist es, auf molekularer Ebene zu verstehen, wie diese Mikroorganismen agieren.“ Daraus wolle man neue Strategien für therapeutische und diagnostische Ansätze ableiten, erklärt der Professor.
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Fusobacterium nucleatum ist ein Bakterienstamm, der sich im Laufe der Evolution früh von anderen bekannten Bakterien wie zum Beispiel Escherichia coli (E. coli) entfernt hat. Wissenschaftliche Erkenntnisse, die für den gut erforschten Modellorganismus E. coli gelten, können somit nicht notwendigerweise auf den Mundhöhlenkeim übertragen werden. Ebenso bedarf es neuer genetischer Werkzeuge, um dem Geheimnis der Fusobakterien auf die Spur zu kommen. Die bisherige Forschung hat sich ohne diese vor allem auf den Wirt konzentriert.
Die Würzburger Wissenschaftler:innen haben ein dringend benötigtes Instrumentarium für den Einsatz in Fusobacterium nucleatum entwickelt und erstmals auch ein Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren etabliert, mit dem wir die Mikroorganismen darstellen und verfolgen können. Mithilfe ihrer genetischen Werkzeuge hat das Team einen Faktor entdeckt, der womöglich zur Kontrolle der Adhäsion der Onkomikroben an Tumorzellen beiträgt.
In einer vorangegangenen Untersuchung hatten die Wissenschaftler:innen bereits festgestellt, dass eine kleine regulatorische Ribonukleinsäure, sogenannte sRNA, ein Protein der äußeren bakteriellen Zellmembran reguliert. Jetzt konnten sie diesen Mechanismus genauer analysieren und einen beteiligten spezifischen Anpassungsfaktor finden, der verschiedene Proteine der Zellhülle unterdrückt. Dieser Anpassungsfaktor zeigte sich unempfindlich gegenüber äußeren Stressoren, reagierte jedoch stark auf Sauerstoff. Das Gas aktivierte den Anpassungsfaktor, der wiederum die sRNA hochfuhr.
Das bereits von anderen Mikroben wie E. coli bekannte Regulierungsprinzip auch in Fusobacterium nucleatum nachweisen zu können, sei vor dem Hintergrund der evolutionären Distanz durchaus überraschend. Zugleich sei es verlockend zu spekulieren, dass der Anpassungsfaktor wie ein Sensor für die Bakterienumgebung fungiere und, vermittelt durch Sauerstoff, die Zellhülle umgestalte.
Fusobakterien nutzen die Proteine ihrer Zellhülle für die Interaktion mit dem Wirt. Ob jedoch die beschriebenen Prozesse ursächlich dafür sind, dass der Mundhöhlenkeim Tumorgewebe besiedelt, muss noch weiter untersucht werden. Die aktuellen Erkenntnisse und die neuen genetischen Tools sollen dazu beitragen, die weiterführende wissenschaftliche Forschung auf diesem Weg zu beschleunigen.
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Die Rolle von RNA in Fusobacterium nucleatum
Die Vogel Stiftung Dr. Eckernkamp unterstützt ein neues Forschungsprojekt am Würzburger Helmholtz-Institut (HIRI). Es zielt auf die Wechselwirkungen von Fusobakterien und Krebs. Die Mikroorganismen treten bei verschiedenen Tumoren auf und können den Krankheitsverlauf negativ beeinflussen. Die ursächlichen molekularen Zusammenhänge zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln, hat sich Valentina Cosi zur Aufgabe gemacht. Die HIRI-Doktorandin ist bereits die zweite Wissenschaftlerin, die im aktuellen Förderzeitraum des Fellowship-Programms der Vogel Stiftung ein Stipendium erhält.
Als Doktorandin im Labor von Jörg Vogel hat sich Valentina Cosi sogenannten Antisense Oligomeren (ASOs) - kurzen Nukleinsäureketten - verschrieben. „Herkömmliche Arzneimittel sind zum Beispiel darauf ausgelegt, die Funktion bestimmter Eiweißmoleküle zu hemmen. Antisense Oligomere setzen bereits im Entstehungsprozess solcher Proteine an, um hier gezielte Veränderungen herbeizuführen“, so die Eckernkamp-Stipendiatin. Das funktioniert, weil ASOs direkt an eine Boten-Ribonukleinsäure (mRNA), also an den Bauplan eines Proteins, binden können.
Bakterielle Vielfalt und Einzelzell-Transkriptomik
In einer Population von Bakterien sind nicht alle Individuen identisch. Manche stehen vielleicht kurz vor einer Zellteilung, andere differenzieren sich aus, wieder andere sind im Begriff, sich an veränderte Umweltbedingungen anzupassen. Gerade mit Blick auf Krankheitserreger ist es der Forschung wichtig, diese Vielfalt innerhalb einer Bakterienpopulation so gut wie möglich zu verstehen. Denn dieses Wissen kann dabei helfen, verbesserte Therapien zu entwickeln.
Eine Technologie, die bei der Analyse der Bakterienvielfalt hilft, ist die Einzelzell-Transkriptomik. Mit ihr lässt sich anhand kleiner Botenmoleküle (mRNA) erfassen, welche Gene in den einzelnen Bakterienzellen einer Population zu einem bestimmten Zeitpunkt aktiv sind. Auch bei komplex zusammengesetzten Bakteriengruppen zeigt die mRNA-Analyse, wie die einzelnen Bakterienzellen auf Antibiotika oder andere Umweltveränderungen reagieren.
Bakterielles MATQ-seq
Forschende der Julius-Maximilians-Universität (JMU) Würzburg und des Würzburger Helmholtz-Instituts für RNA-basierte Infektionsforschung (HIRI) haben eine innovative Variante der bakteriellen Einzelzell-Transkriptomik entwickelt. Das Verfahren heißt bakterielles MATQ-seq und hat einige Vorzüge.
Die Würzburger Forschenden haben ihre Methode seitdem weiter ausgearbeitet. Im Journal Nature Protocols präsentieren sie nun ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, also eine genaue Anleitung zur Erstellung von Einzelbakterien-Transkriptomen mit MATQ-seq. Das Protokoll umfasst auch die experimentelle und computergestützte Analyse der Daten.
Dr. Christina Homberger vom JMU-Institut für molekulare Infektionsbiologie (IMIB), die inzwischen am Biozentrum der Universität Basel forscht, sagt, dass sie auf Basis der quantitativen Einzelzell-RNA-Sequenzierung ein robustes bakterielles scRNA-seq-Protokoll entwickelt haben. Anhand von Modellorganismen wie Salmonella enterica zeigen sie, dass die Methode sehr effizient ist. Man erreiche damit eine sehr hohe Zell-Retentionsrate von 95 Prozent - das bedeutet, dass am Ende des Verfahrens von 95 Prozent der eingangs verwendeten Zellen tatsächlich auch individuelle Genbibliotheken erstellt werden. Das übertreffe andere Protokolle ganz erheblich: Diese hätten Verlustraten von bis zu 70 Prozent.
Fabian Imdahl sagt, dass ihre Methode zuverlässig die Aktivität von 300 bis 600 Genen pro Bakterienzelle erkennt. Auch das ist im Schnitt deutlich mehr als andere Methoden derzeit erreichen. Anhand der erfassten Genaktivitäten könne man sehr gut erkennen, was ein einzelnes Bakterium gerade tut oder auf welche Umweltbedingung es sich aktuell anpasst.
Die gesamte Prozedur - von der Einzelzellisolierung bis zur Rohdatengenerierung - dauert mit MATQ-seq etwa fünf Tage. Sie ist ideal für kleinere Proben aus hunderten von Zellen; in diesem Bereich funktioniert sie sehr effizient und mit hoher Auflösung. Für einen hohen Zelldurchsatz im Bereich von hunderttausenden bis hin zu Millionen von Zellen eignen sich eher andere Protokolle, wobei hier ein hoher Verlust von Zellen und die Detektion von weniger als 100 Genen pro Zelle in Kauf zu nehmen ist.
Center for Microbial Single-Cell RNA-seq (MICROSEQ)
Professor Jörg Vogel, Direktor des HIRI und des IMIB, erklärt, dass ihr Protokoll die robuste Analyse verschiedener Bakterienspezies ermöglicht und damit die Grundlage für den Aufbau einer weltweit einzigartigen mikrobiellen Einzelzell-RNA-Sequenzierungsplattform hier in Würzburg bildet. Die Plattform soll dazu dienen, Protokolle und Expertise zu bündeln und die Technologien anderen Forschenden und Laboren zugänglich zu machen.
Die neue Plattform heißt Center for Microbial Single-Cell RNA-seq (MICROSEQ): „Sie basiert auf den von uns entwickelten Technologien und etablierten Hochdurchsatz-Methoden für die Transkriptomanalyse einzelner Bakterien.“ Forschungsgruppen aus aller Welt können dort künftig Zugriff auf Technologien zur Einzelzell-Transkriptomik von Bakterienzellen bekommen.
MICROSEQ entsteht als Teil des Würzburger Single-Cell Centers, das schon jetzt Transkriptomanalysen einzelner eukaryotischer Zellen anbietet.
Verbindung zu Hirndurchblutungsstörungen
Obwohl der Schwerpunkt der bisherigen Forschung auf der Rolle von Fusobacterium nucleatum bei Krebserkrankungen lag, gibt es zunehmend Hinweise auf einen möglichen Zusammenhang mit Hirndurchblutungsstörungen. Studien haben gezeigt, dass orale Bakterien, einschließlich Fusobacterium nucleatum, in Gehirninfarkten nachgewiesen werden können. Es wird vermutet, dass diese Bakterien über verschiedene Wege, wie z. B. die Blutbahn, ins Gehirn gelangen und dort Entzündungen und die Bildung von Blutgerinnseln fördern können, was letztendlich zu Durchblutungsstörungen führt.
Zukünftige Forschungsrichtungen
Die Kartografierung des Fuso-Transkriptoms stellt eine wichtige Grundlage für die künftige Therapie von Krebserkrankungen dar. Auf ihrer Basis könnten in einem nächsten Schritt Gene identifiziert werden, auf die eine Behandlung zielen kann, um das Fusobacterium in Karzinomen zu beseitigen und das Krebswachstum einzudämmen.
Um den Zusammenhang zwischen Fusobacterium nucleatum und Hirndurchblutungsstörungen besser zu verstehen, sind jedoch weitere Forschungsarbeiten erforderlich. Zukünftige Studien sollten sich auf die Aufklärung der Mechanismen konzentrieren, durch die dieses Bakterium ins Gehirn gelangt, sowie auf die Untersuchung seiner Auswirkungen auf die Gehirngefäße und die Entzündungsreaktion. Darüber hinaus sind klinische Studien erforderlich, um festzustellen, ob eine gezielte Bekämpfung von Fusobacterium nucleatum das Risiko von Hirndurchblutungsstörungen verringern kann.
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