Die Patch-Clamp-Technik ist eine hochpräzise Methode zur Messung von Ionenströmen durch einzelne Kanäle in Zellmembranen. Sie hat die elektrophysiologische Forschung revolutioniert und ist Standard in Laboren weltweit. Mit ihr können Forschende den Ionenstrom durch einen einzigen Ionenkanal genau messen. Die Technik verwendet eine feine Glaspipette, die dicht an die Zellmembran angesaugt wird.
Einführung in die Patch-Clamp-Technik
Die Patch-Clamp-Methode ist ein grundlegendes Werkzeug in der modernen Neurobiologie. Sie ermöglicht es Wissenschaftlern, die Funktionsweise einzelner Ionenkanäle in Nervenzellen zu untersuchen. Hierbei wird eine feine Glasspipette mit einer Messelektrode präzise auf die Membran eines Neurons platziert.
Historischer Kontext und Nobelpreis
Die Patch-Clamp-Technik wurde 1976 von den Göttinger Forschern Erwin Neher und Bert Sakmann am damaligen Max-Planck-Institut (MPI) für biophysikalische Chemie (heute: MPI für Multidisziplinäre Naturwissenschaften) entwickelt. Damit ließ sich erstmals der extrem schwache elektrische Strom durch einen einzelnen geöffneten Ionenkanal in einer Nervenzelle messen. Im Jahr 1991 erhielten Neher und Sakmann dafür den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin.
Bedeutung für die Neurobiologie
Für Studierende der Neurobiologie ist das Verständnis der Patch-Clamp-Technik von grundlegender Bedeutung. Es bietet eine solide Grundlage für weiterführende Neurobiologie Übungsaufgaben mit Lösungen und ermöglicht ein tieferes Verständnis der komplexen Vorgänge in unserem Nervensystem. Die Patch-Clamp-Technik ermöglicht präzise Untersuchungen von Ionenströmen durch Nervenzellmembranen und bestätigt die Existenz gesteuerter Ionenkanäle.
Grundlagen der bioelektronischen Kopplung
Ionenkanäle: Kanäle für Kommunikation
Poren bildende Proteine in lebenden Zellen, auch Ionenkanäle genannt, sind in die äußere Membran fast aller Zelltypen eingelagert und spielen eine entscheidende Rolle in den verschiedenen Nachrichtensystemen in unserem Körper. Blut-, Immun- oder Leberzellen kommunizieren darüber. Nervenzellen leiten über Ionenkanäle elektrische Signale an andere Zellen weiter.
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Ruhepotential und Aktionspotential
Das Ruhepotential einer Zelle ist die elektrische Potentialdifferenz über die Zellmembran im Ruhezustand. Ein Aktionspotential entsteht, wenn ein Neuron einem Reiz ausgesetzt wird, was zu einer Änderung der Stromstärke führt. Wenn ein Neuron einem Reiz ausgesetzt wird, kann der Ionenfluss durch den Kanal über die Änderung der Stromstärke ermittelt werden.
Die Hodgkin-Huxley-Theorie
Die Hodgkin-Huxley-Theorie beschreibt die mathematischen Grundlagen der Entstehung und Ausbreitung von Aktionspotentialen in Nervenzellen. Sie basiert auf der Untersuchung spannungsabhängiger Ionenkanäle.
Die Patch-Clamp-Technik im Detail
Messprinzip
Bei der Durchführung des Experiments wird die Zelle einem Reiz ausgesetzt. Example: Wenn ein Neuron einem Reiz ausgesetzt wird, kann der Ionenfluss durch den Kanal über die Änderung der Stromstärke ermittelt werden. Die Patch-Clamp-Technik liefert somit wichtige Erkenntnisse über den Aufbau und die Funktion von Neuronen.
Verschiedene Patch-Clamp-Konfigurationen
Es gibt verschiedene experimentelle Patch-Clamp-Konfigurationen, die es ermöglichen, Ionenströme unter verschiedenen Bedingungen zu messen. Dazu gehören die Cell-Attached-, Inside-Out-, Outside-Out- und Whole-Cell-Konfigurationen.
Vorteile und Grenzen der Patch-Clamp-Technik
Patch-Clamp-Messungen sind sehr genau. Sie liefern aber keine detaillierten Informationen darüber, wie Ionen einen Kanal passieren, welche Wechselwirkungen sie dabei mit anderen Ionen und Molekülen eingehen und was Ionenkanäle für eine bestimmte Ionenart so effizient und selektiv macht.
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Fortschritte durch Molekulardynamik-Simulationen
Was im Inneren eines Kanals passiert, lässt sich mit der Patch-Clamp-Technik jedoch nicht beobachten. Ein Forschungsteam um Bert de Groot hat jetzt mithilfe von Molekulardynamik-Simulationen erstmals in atomarer Auflösung sichtbar gemacht, wie Kaliumionen einen Kaliumionenkanal passieren. Die dabei zugrunde gelegten Berechnungen stimmten präzise mit den Patch-Clamp-Messungen überein.
Atomistische Simulationen
„Molekulardynamik-Simulationen können den experimentellen Aufbau Atom für Atom nachahmen und so Aufschlüsse über Vorgänge geben, die wir nicht experimentell beobachten können“, erklärt Bert de Groot, Forschungsgruppenleiter am MPI für Multidisziplinäre Naturwissenschaften. Die Kontrolle dafür, dass diese Simulationen korrekt sind, ist, dass sie präzise mit den durch die Patch-Clamp-Methode gemessenen Ionenströmen übereinstimmen müssen. Und genau hier hakte es in bisher durchgeführten Simulationen: Sie stimmten nicht genau mit den experimentell gemessenen Strömen überein.
Präzise Berechnung von Ionenströmen
Fast 50 Jahre nach Entwicklung der Patch-Clamp-Technik gelang es dem Team um de Groot in Kooperation mit Forschenden an der Queen Mary University London (Großbritannien) die experimentell gemessenen Ströme durch Ionenkanäle präzise zu berechnen. Mithilfe von atomistischen Molekulardynamik-Simulationen, bei denen die sogenannte effektive elektronische Polarisation mit einbezogen wurde, konnte das Forschungsteam die Genauigkeit dieser Berechnungen deutlich verbessern.
Selektivität von Ionenkanälen
Den Forschenden gelang es mit diesen verbesserten Berechnungen zum ersten Mal, realistisch abzubilden, wie Kaliumionen einen Kaliumkanal passieren und wie anderen Ionen der Zutritt erfolgreich verwehrt wird. Wie genau die Passage der Ionen durch den Kanal erfolgt, war bislang umstritten. Während frühere Daten darauf hindeuteten, dass die einzelnen Kaliumionen durch Wassermoleküle im Kanal getrennt werden, lassen die aktuellen Ergebnisse von de Groots Team darauf schließen, dass sich bis zu vier Kaliumionen beim Durchqueren des Kaliumkanals wie auf einer Perlenschnur aneinanderreihen.
Bedeutung für die Pharmaforschung
Da Ionenkanäle wichtige Angriffspunkte für Medikamente sind, sei ein Verständnis ihrer Funktion von großer Bedeutung für die Pharmaforschung.
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Aktionspotential Grundlagen
Messung des Aktionspotentials
Die Messung des Aktionspotentials erfolgt durch gezielte elektrische Reizung des Axons und anschließende Beobachtung der Reaktion mittels Elektroden und eines Oszilloskops. Bei der Messung wird deutlich, dass eine positive Reizspannung zu einer lokalen Verringerung des Membranpotentials führt.
Depolarisation und Alles-oder-Nichts-Gesetz
Überschreitet diese Depolarisation einen bestimmten Schwellenwert, kommt es zur rapiden Änderung des Membranpotentials bis zu einem Spitzenwert von +30 mV. Die schnelle und starke Veränderung des Membranpotentials nach Überschreiten der Schwelle wird als Depolarisationsphase bezeichnet. Ein wichtiges Prinzip bei Aktionspotentialen ist das Alles-oder-Nichts-Gesetz.
Molekulare Mechanismen
Auf molekularer Ebene lassen sich die Veränderungen des Membranpotentials durch Änderungen der Ionenkonzentrationen an der Axonmembran erklären. In Experimenten wurden außerhalb des Axons Na+-Ionen durch größere, positiv geladene Ionen ersetzt.
Anwendung der Patch-Clamp-Technik zur Untersuchung von Ionenkanälen
Isolierung von Membranbereichen
Bei dieser Technik wird eine Glasmikropipette durch Ansaugen an der Zellmembran befestigt, wodurch ein sehr kleiner Membranbereich isoliert und analysiert werden kann.
Untersuchung spezifischer Ionenkanäle
Durch die Blockierung spezifischer Kanäle, wie beispielsweise Natriumionenkanäle, kann man gezielt untersuchen, welche Ionen durch welche Kanäle diffundieren.
Sensoren für die zelluläre Signaldetektion
Feldeffekttransistoren (FET) und Extended-Gate-Elektroden (EGE)
Feldeffekttransistoren (FET) und Extended-Gate-Elektroden (EGE) werden als Sensoren für die zelluläre Signaldetektion eingesetzt. Durch einen modifizierten Prozessablauf kann ein extrazellulärer Sensor hergestellt werden. Der Einsatz solcher Meßsysteme im Bereich der Pharmakologie kann die Zahl der aufwendigen invasiven Messprogramme deutlich reduzieren.
Kopplung von Zellen und Sensoren
Die Kopplung zwischen Zellen und Sensoren kann auf verschiedene Weisen erfolgen. Das Punkt-Kontakt-Modell beschreibt die Kopplung zwischen einer Zelle und einem Sensor im direkten Kontaktbereich.
Experimentelle Ergebnisse mit Kardiomyozyten
Experimente mit Kardiomyozyten zeigen, dass diese Zellen auf den Sensoren entwickelt werden können und extrazelluläre Signale detektiert werden können. Die Signale können durch verschiedene Stimulationsprotokolle aktiviert werden.
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