Einführung
Die Informationsverarbeitung im Gehirn ist ein komplexer Prozess, der auf der Kommunikation zwischen etwa 100 Milliarden Nervenzellen basiert. Diese Kommunikation erfolgt über spezielle Kontaktstellen, die Synapsen genannt werden. Synapsen spielen eine grundlegende Rolle bei der Signalübertragung und -verarbeitung im Gehirn, wobei die Calyx of Held, eine Riesensynapse im auditorischen Hirnstamm, ein besonders interessantes Modell für Untersuchungen zur synaptischen Übertragung darstellt.
Die Rolle der Synapsen bei der Informationsverarbeitung
Synapsen sind die Kontaktpunkte zwischen Neuronen, über die Nervenzellen miteinander kommunizieren. Dabei werden Transmitter-gefüllte Vesikel auf einen elektrischen Impuls der präsynaptischen Nervenzelle hin mit der Zellmembran fusioniert und daraufhin ein Botenstoff freigesetzt, der die postsynaptische Nervenzelle in ihrer elektrischen Aktivität beeinflusst. Die Signale von Synapsen können sich je nach Aktivitätslevel dynamisch ändern (short-term plasticity), was eine flexible Anpassung der Signalübertragung ermöglicht. Damit Nervenzellen auch bei wiederholten Reizen Neurotransmitter freisetzen können, halten diese an jeder synaptischen Kontaktstelle einen Pool von drei bis acht bereits angedockten und sekretionsbereiten Vesikeln bereit.
Die Calyx of Held als Modellsystem
Die Calyx of Held ist eine Riesensynapse im auditorischen Hirnstamm, die zeitlich präzise Hörinformation verarbeitet und u.a. wichtige Beiträge zur Schalllokalisation leistet. Aufgrund ihrer extremen Größe etablierte sich die Calyx of Held in den letzten Jahren zu einem der Standardmodelle für Untersuchungen zur synaptischen Übertragung. Die Nervenendigungen sind in dieser Zelle so groß, dass elektrische Messungen mit dem Patch-Clamp-Verfahren direkt an der präsynaptischen Nervenendigung durchgeführt werden können. Dadurch ist es möglich, nicht nur die Ströme von Kalzium-Ionen (Ca2+) im Nerventerminal zu messen, sondern Ca2+-Indikatorfarbstoffe und photolysierbare Ca2+-Chelatoren über die Patch-Pipette unmittelbar in das Zytoplasma der Nervenendigung einzuschleusen. Auf diese Weise kann die Ca2+-aktivierte Vesikelfusion in der Nervenendigung gezielt ausgelöst werden.
Untersuchungen zur synaptischen Übertragung an der Calyx of Held
Die Untersuchungen an der Calyx of Held werden typischerweise in akuten Hirnschnitten durchgeführt, d.h. in Scheiben von lebendem Hirngewebe, welches die Zellen oder Synapsen von Interesse enthält. Diese Schnitte stellen reduzierte Systeme dar, denen eine große Zahl der für das intakte Gewebe typischen Eingänge fehlt, im Fall der Calyx u.a. auch der Eingang vom Hörnerv. Deshalb werden in solchen Versuchen auditorische Signale durch elektrische Stimulationen nachempfunden.
Ältere Versuche imitierten die Schallaktivität, ohne die Spontanaktivität zu berücksichtigen. Neuere Ergebnisse deuten allerdings daraufhin, dass die Spontanaktivität den Grundzustand der Synapsen stark verändert, so dass im intakten Gehirn Schallinformationen immer auf dem Hintergrund der Spontanaktivität verarbeitet werden. In akuten Hirnschnitten hingegen fehlt diese, d.h. Schallinformationen werden gegen einen Hintergrund von artifizieller Inaktivität getestet. Dieser Unterschied hat wichtige Auswirkungen auf viele Details der synaptischen Übertragung, wie z.B. die Amplituden oder das Timing der Signale, bis hin zur Zuverlässigkeit der synaptischen Übertragung selbst.
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Einfluss von cAMP auf die synaptische Vesikelfreisetzung
Kurzzeitplastizität ist eine Eigenschaft aller Synapsen, dennoch sind ihre ursächlichen Mechanismen ungeklärt. In dieser Studie wurde die Rolle des Second messengers cAMP an der glutamatergen Riesensynapse, Held sche Calyx, im auditorischen Hirnstamm untersucht. Durch die Kombination elektrophysiologischer Ableitungen von der Prä- und Postsynapse mit intrazellulären Ca2+ Messungen und Ca2+ uncaging, wurde gefunden, dass eine erhöhte cAMP Konzentration, insbesondere im Bereich niedriger Ca2+ Konzentrationen, die Sensitivität der Neurotransmitter Freisetzung für Ca2+ erhöht. Die Erhöhung der Sensitivität wurde nur bei den schnell freisetzenden , und nicht bei den langsam freisetzenden , synaptischen Vesikeln beobachtet. Ein Fit der Daten mit einem vereinfachten allosterischen Modell zeigt, dass die cAMP die Fusionskompetenz der Vesikel erhöht, wodurch die Transmitterfreisetzung erleichtert wird. Es wird vermutet, dass synaptische Vesikel in der Nähe eines Ca2+-Kanal-Clusters verankert sein müssen, damit cAMP ihre Ca2+ Sensitivität erhöhen kann.
Zusätzlich zur Exozytose habe ich mit Hilfe zeitauflösender Membrankapazitätsmessungen untersucht, ob cAMP einen Effekt auf die Endozytose hat. Es konnte gezeigt werden, dass cAMP/PKA auch bei der Endozytose eine Rolle spielen, da sowohl eine Erniedrigung der cAMP Konzentration als auch eine Inhibition der PKA Aktivität die Endozytose bei starker Stimulation verlangsamten. Calmodulin Blocker verlangsamten die Rate der langsamen Endozytose nach starker, aber nicht nach schwacher präsynaptischer Stimulation. Das Ergebnis war ein langsamerer Zeitablauf der Endozytose, je mehr Endozytose statt fand. Es wird angenommen, dass Calmodulin die Endozytose aktivitätsabhängig erleichtert, aber nicht initiiert. Abschließend wird vermutet, dass cAMP/PKA durch Calmodulin reguliert werden. Zusammenfassend ist cAMP im gesamten synaptischen Vesikel Zyklus von Bedeutung und moduliert Exozytose, Endozytose und die Rekrutierung synaptischer Vesikel in unterschiedlicher Weise: Bei der Membranfusion synaptischer Vesikel beeinflusst cAMP/Epac die Ca2+ Sensitivität für die schnelle Neurotransmitterfreisetzung. Bei der Endozytose spielt Ca2+/calmodulin-cAMP/PKA eine Rolle beim Recycling synaptischer Vesikel.
Die Rolle von Synapsinen bei der synaptischen Transmission
An chemischen Synapsen, werden synaptische Vesikel an Hand ihrer Mobilität und Freisetzungswahrscheinlichkeit verschiedenen funktionellen Pools zugeordnet. Die synaptischen Vesikel des Reservepools werden in den meisten Synapsen durch Synapsine an das Zytoskelett in Regionen entfernt von den aktiven Zonen gebunden. Synapsine können in Abhängigkeit von synaptischer Aktivität phosphoryliert werden, was zu einer Loslösung der Vesikel vom Zytoskelett führt. Die dann freibeweglichen Vesikel können am synaptischen Vesikelzyklus teilnehmen. In Säugern existieren drei Synapsingene die alternativ gespleißt werden, was zu mehr als zehn verschiedenen Isoformen führt. Die funktionellen Unterschiede der verschiedenen Isoformen bei der Regulation der synaptischen Transmission sind bis jetzt nur unzureichend verstanden.
Die funktionellen Eigenschaften der Synapsine wurden in der vorliegenden Arbeit in zwei verschiedenen Ansätzen untersucht. Zum einem wurden Struktur und Funktion von Synapsen untersucht in denen eine Synapsin-I-Isoform (Synapsin Ia oder Synapsin Ib) überexprimiert wurde, zum anderen die synaptische Transmission und die strukturelle Integrität von Synapsen bei denen alle drei Synapsingene ausgeschaltet wurden (triple knock- out (TKO)). Als Modelsynapse für beide Ansätze diente der Held’sche Calyx, eine glutamaterge Riesensynapse im auditorischen Hirnstamm.
Eine Überexpression von Synapsin-I-Isoformen wurde durch Transduktion von globular bushy cells (GBCs) im ventralen choclearen Nucleus mit rekombinanten adeno- assoziierten viralen Partikel erreicht. GBCs sind Projektionsneurone die im medialen Kern des kontralateralen Trapezkörpers die Held’schen Calyces bilden. Zehn Tage nach der Transduktion führte die Überexpression zu einer Umverteilung der synaptischen Vesikel innerhalb des Held’schen Calyx, dessen allgemeine Struktur nicht verändert wurde. Die ultrastrukturelle Analyse mittels serial sectioning scanning Elektronenmikroskopie (S3EM) ergab dass weniger synaptische Vesikel in unmittelbarer Nähe zur aktiven Zone vorhanden waren. Da die Gesamtanzahl der synaptischen Vesikel nicht verändert war, ergab sich also eine Umverteilung der Vesikel bei Synapsin I Überexpression.
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Auf der funktionellen Ebene hatte die Überexpression von Synapsin I keinen Effekt auf spontane oder aktionspotentialabhängige Vesikelfreisetzung. Lediglich bei wiederholter Stimulation mit mehr als 10 Hz wurde eine beschleunigte Kurzzeitermüdung beobachtet. Die Erholung von dieser Ermüdung wurde allerdings auch durch beide Synapsin I Isoformen beschleunigt. Bei der Untersuchung der Gehirne von TKO-Mäusen wurde eine starke Reduktion mehrer vesikulärer Proteine festgestellt, während Proteine der aktiven Zone und der postsynaptischen Dichte nicht betroffen waren. Dementsprechend wiesen auf Immunfluoreszenz basierende 3D Rekonstruktionen von TKO-Calyces reduzierte Mengen des synaptischen Proteins vGluT1 aber nicht des aktiven Zonen-Markers Bassoon auf. Die ultrastrukturelle Analyse mittels S3EM bestätigte diese Befunde, da TKO-Calyces eine um 50% reduzierte Anzahl von synaptischen Vesikeln aufwiesen.
Diese strukturellen Veränderungen in der Abwesenheit von Synapsinen resultierten in einer beschleunigten und ausgeprägteren Kurzzeitermüdung bei Stimulationsfrequenzen über 100 Hz. Die Erholung von der Kurzzeitermüdung war, im Gegensatz zu Calyces die Synapsin I überexprimieren, in TKO-Calyces verlangsamt. Dies lässt vermuten, dass die Synapsin-abhängigen Vesikel zum schnellen Auffüllen des readily-releasable Pools, der die Vesikel zur Aufrechterhaltung der synaptischen Transmission stellt, beitragen. Trotz der strukturellen Defekte und der veränderten Kurzzeitermüdung wurde auch bei hohen Stimulationsfrequenzen kein Versagen der synaptischen Transmission beobachtet, was darauf hindeutet, dass der Anteil der Synapsin-abhängigen synaptischen Vesikel am readily-releasable Pool begrenzt ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Synapsine für die Aufrechterhaltung einer spezifischen Vesikelpopulation an ZNS Synapsen nötig sind. Diese Vesikel sind allerdings während normaler synaptischer Transmission entbehrlich und werden erst bei dauerhafter, hochfrequenter Aktivität rekrutiert. Eine Erweiterung des readily-releasable Pools um diese Vesikelpopulation minimiert die präsynaptische Kurzzeitermüdung da mehr Vesikel zur Verfügung stehen die zur Erholung beitragen können.
Kalzium-Regulation der Vesikelfusion
Die Forscher um Ralf Schneggenburger konnten nun erstmals direkt nachweisen, dass Phorbolester, welche den Proteinkinase-C / Munc-13-Signalweg aktivieren, zu einer Erhöhung der Kalzium-Sensitivität der Vesikelfusion führen, ohne dass sich der Pool schnell freisetzbarer Vesikel nennenswert erhöht. Dieser Modulationsweg ist energetisch günstig für die Nervenendigung, da die Bereitstellung einer höheren Zahl sekretionsbereiter Vesikel ansonsten mit einem Verbrauch von ATP einherginge. Die Ergebnisse werfen auch ein neues Licht auf den Zusammenhang zwischen der Kalzium-vermittelten und der Kalzium-unabhängigen Fusion von Vesikeln mit der Zellmembran. Bisher hatte man angenommen, dass die "spontane" Fusion von Vesikeln in unstimulierten Nervenzellen unabhängig von Kalzium erfolgt, und möglicherweise von einer speziellen Gruppe angedockter Vesikel übernommen wird. Doch wie die Forscher nun zeigen konnten, treten spontane Vesikelfusionen am unteren Ende derselben Dosis-Wirkungskurve auf, die den Zusammenhang zwischen der Kalzium-vermittelten Vesikelfusionsrate und der intrazellulären Kalzium-Konzentration beschreibt.
Überraschend stellten die Forscher jedoch fest, dass bei niedrigen Kalzium-Konzentrationen bereits ein bis zwei Ca2+-Ionen ausreichen, um ein Vesikel zur Fusion zu bringen. Bei höheren Ca2+-Konzentrationen sind dann zunehmend mehr, bis zu vier oder fünf Ca2+-Ionen notwendig, um die Fusion eines einzelnen Vesikels auszulösen. Diese Befunde zeigen, dass die Kalzium-Regulation der Vesikelfusion weitaus komplexer ist als bisher angenommen. Die Empfindlichkeit für Kalzium wird offenbar direkt durch intrazelluläre Signalwege gesteuert, wie die Aktivierung des Proteinkinase-C / Munc-13 Signalweges, wobei derselbe Kalzium-Sensor sowohl die Ca2+-getriebene als auch die spontane Vesikelfusion steuert. Dieser Sensor besteht vermutlich aus einem Komplex präsynaptischer Proteine, der durch so genannte SNARE-Proteine (engl.: soluble NSF-attachment protein receptor) sowie weitere angelagerte Proteine, wie die Synaptotagmine, gebildet wird. Zudem deuten die Untersuchungsergebnisse darauf hin, dass noch weitere präsynaptische Proteine, wie Munc-13, die durch Diazylglycerin aktiviert werden, die Kalzium-Sensitivität der Vesikelfusion beeinflussen.
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Bedeutung der Calyx of Held für die Schalllokalisation
Mit einer bemerkenswerten Genauigkeit können Menschen wie auch die meisten Säugetiere den Ursprung eines Geräuschs lokalisieren. Diese Fähigkeit begleitet uns den ganzen Tag über - sei es beim Überqueren der Straße oder bei der Ortung eines klingelnden Handys. Das Gehirn benutzt für die Ortung einer Schallquelle den Zeit- und Intensitätsunterschied des ankommenden Schallsignals zwischen beiden Ohren. Das Team um Professor Ralf Schneggenburger hat nun die Rolle eines bestimmten Proteins entschlüsselt, welches das Wachstum dieser gigantischen Synapse anstößt. Normalerweise empfangen Neuronen tausende von Kontaktpunkten - bekannt unter der Bezeichnung Synapse - von vorgeschalteten Neuronen. Innerhalb eines bestimmten Zeitfensters muss ein Neuron mehrere erregende synaptische Signale erhalten, um selbst einen elektrischen Impuls aussenden zu können. Im auditorischen Teil des Hirns ist dies anders. Synapsen wachsen oft bis zu einer extremen Größe heran: Diese Riesensynapsen heißen Held'sche Calyxsynapsen nach ihrem Entdecker Hans Held, Leipziger Anatom vor mehr als 100 Jahren. Da sie über mehrere hunderte von Kontaktpunkten verfügen, sind sie in der Lage auch ein Signal allein zu ihrem nachgeschalteten Neuron zu senden.