Agrin, ursprünglich als Schlüsselakteur bei der Bildung und Aufrechterhaltung der neuromuskulären Endplatte bekannt, entpuppt sich zunehmend als ein vielseitiges Molekül mit wichtigen Funktionen im zentralen Nervensystem (ZNS). Dieser Artikel beleuchtet die vielfältigen Rollen von Agrin im ZNS, von seiner Beteiligung an der Synaptogenese und synaptischen Plastizität bis hin zu seiner potenziellen Bedeutung bei der Entstehung von Hirnödemen.
Agrin und MuSK im ZNS: Eine unerwartete Verbindung
Die Muskel-spezifische Tyrosinkinase (MuSK) ist ein Protein, das in Muskelfasern exprimiert wird und dort die Bildung der neuromuskulären Endplatten vermittelt. Es wurde jedoch gezeigt, dass MuSK auch im zentralen Nervensystem exprimiert wird. MuSK konnte im Gehirn und im Auge von Nagetieren nachgewiesen werden. In der Retina wird MuSK im Alter von 7 bis 14 Tagen nach der Geburt in Astrozyten exprimiert, was der Zeitspanne entspricht, in der sich die Augen öffnen. Interessanterweise wurde auch Agrin, ein Aktivator von MuSK in Muskelzellen, im zentralen Nervensystem nachgewiesen. Agrin ist in Nachbarschaft zu den MuSK-exprimierenden Astrozyten lokalisiert, die sich nahe der inneren begrenzenden Membran der Nagetier-Retina befinden.
Diese Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass MuSK zusätzlich zu seiner bekannten Funktion bei der Ausbildung der neuromuskulären Endplatte auch bei der Entwicklung des Nervensystems eine Rolle spielt. Um die Funktionen von MuSK aufzuklären, ist es erforderlich, Proteine zu identifizieren, die als Interaktionspartner und/oder Effektoren von MuSK agieren. Zu diesem Zweck wurden Hefe-2-Hybrid-Analysen durchgeführt. Unter den in diesen Untersuchungen entdeckten Proteinen waren die ß-Untereinheit der Proteinkinase CK2 (CK2ß) und der carboxyterminale Bereich des ErbB2-interagierenden Proteins (Erbin). Weiterführende Interaktionsstudien zeigten, dass nicht nur die regulatorische ß-Untereinheit der Proteinkinase 2, sondern auch deren katalytische beta-Untereinheit mit MuSK interagieren kann.
Neurotrypsin und Agrin: Ein Schlüssel zur synaptischen Plastizität
Verschiedene Studien implizieren die Rolle von extrazellulären Proteasen in der synaptischen Plastizität, im synaptischen Lernen sowie der synaptischen Erinnerung. Der neuronalen, Trypsin-ähnlichen Serinprotease Neurotrypsin (NT) wird eine wichtige Rolle in der kognitiven Gehirnfunktion zugeschrieben, weil eine 4-Nukleotid-Mutation, welche ein früheres Stopcodon zur Folge hat, mit schwerwiegenden geistigen Behinderungen bei Menschen in Verbindung gebracht wird. Zudem wurde kürzlich veröffentlicht, dass CIn1-/--Mäuse, ein Maus-Modell neurodegenerativer, lysosomaler Speicherkrankheiten, in denen die Neurotrypsin-Aktivität durch die Hochregulierung des Hemmstoffs Serpina1 unterdrückt wurde, eine stark reduzierte Konzentration von Agrin-22 (das Produkt von Neurotrypsin-abhängiger Zellteilung von Agrin) zeigen. Dies kann mit der synaptischen Funktionsstörung der Krankheit zusammenhängen.
Im zentralen Nervensystem von Erwachsenen (ZNS) wird NT-mRNA hauptsächlich im Hippokampus, der Großhirnrinde und der Amygdala ausgeschüttet. Im sich entwickelnden Gehirn einer Maus wird NT-mRNA verstärkt in der Großhirnrinde und im Hippokampus exprimiert, wobei die NT-mRNA-Expression während der neuralen Entwicklung am höchsten ist. Außerdem korreliert die NT-mRNA-Expression mit den Phasen der Synaptogenese. Mit Hilfe von Elektronenmikroskopie wurde NT an den präsynaptischen Enden von menschlichen, kortikalen Synapsen lokalisiert. Live-Imaging-Studien an kultivierten Hippokampus-Neuronen zeigten dabei, dass NT von den Synapsen in einer aktivitätsabhängigen Art und Weise erneuert und ausgeschüttet wird. Die proteolytische Aktivität von NT erfordert interessanterweise die synchrone Aktivierung von NMDA-Rezeptoren. Demnach wird NT von den präsynaptischen Enden in seiner inaktiven Form abgegeben und erst im extrazellulären Raum von einem postsynaptischen, NMDAR-abhängigen Mechanismus aktiviert.
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Das einzig bekannte Substrat für NT ist Agrin, ein Molekül der extrazellulären Matrix (ECM). Synaptisches Agrin wird von NT an den zwei Seiten a und b geteilt, woraus ein N-terminales Fragment (110 kDa), ein internes Fragment (90 kDa) und ein C-terminales Fragment (22 kDa) entstehen. In NT-Knockout-Mäusen können keine proteolytischen Fragmente von Agrin nachgewiesen werden, was eine exklusive Verarbeitung Agrins von NT im ZNS vermuten lässt. Aktivitätsabhängige Exozytose von NT in präsynaptischen Nervenenden und die Teilung von Agrin führen zur Entstehung dendritischer Filopodien im Kontext der NMDA-Rezeptor-abhängigen Plastizität. Gestützt wird dies durch den Befund, dass in NT-Knockout-Mäusen keine aktivitätsabhängige Bildung von dendritischen Filopodien beobachtet werden konnte. Die aktivitätsabhängige Bildung von Filopodien konnte bei diesen Mäusen jedoch durch die Verwendung von Agrin-22 wiederhergestellt werden, wohingegen Agrin-90 keine Wirkung erzielte. Agrin-22 erzeugt dendritische Filopodien durch seine Bindung und Hemmung von neuronaler alpha3-Na+/K+-ATPase (a3NKA). Zusammenfassend qualifizieren diese Ergebnisse Neurotrypsin-abhängige Agrin-Zellteilung als einen Koinzidenzdetektor für die korrelierende Aktivität des präsynaptischen und des postsynaptischen Neurons mit einer möglichen Mitwirkung bei der Synapsen-Entstehung und somit des Hebbschen Lernens.
In einer Doktorarbeit wurde die vermeintliche Mitwirkung von Neurotrypsin in der funktionalen, synaptischen Plastizität, den verschiedenen Typen und Phasen des Lernens, dem sozialen Verhalten sowie der Genese und der Morphologie von Dornfortsätzen sowohl unter naiven Bedingungen als auch im Lernprozess untersucht. Die Ergebnisse zeigten Beeinträchtigungen von speziellen Formen der Langzeitpotenzierung, des Verhaltens sowie starke Unterschiede der Dornfortsätze bei Mäusen mit einem NT-Defizit verglichen mit ihren WT-Wurfgeschwistern.
TGF-β2 und Agrin: Modulation der Nerv-Muskel-Interaktion
Die transformierenden Wachstumsfaktoren-beta (TGF-β) stellen eine Superfamilie von Proteinen dar, die in der Entwicklung und Differenzierung des Nervensystems unterschiedlichste Funktionen erfüllen. Ihre Rolle in der Synaptogenese in Säugetieren ist jedoch bislang nur teilweise untersucht und insbesondere zur Funktion der Isoformen TGF-β1, -β2 und -β3 liegen keine Befunde vor. Das Ziel einer Arbeit war daher, die biologische Bedeutung von TGF-β2 in der Entstehung und Funktion von Synapsen zu untersuchen. Als Modell dienten dabei embryonale TGF-β2-defiziente Mäuse, in denen Synapsen des peripheren und zentralen Nervensystems untersucht wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Innervation des Zwerchfells, die Faszikulation des Nervus phrenicus und die Morphologie der neuromuskulären Endplatte durch die Deletion von TGF-β2 nicht beeinträchtigt wurden. Es wurde jedoch eine signifikant reduzierte Anzahl von neuromuskulären Endplatten festgestellt und in vitro-Experimente mit C2C12-Zellen gaben einen Hinweis darauf, dass diese Reduzierung durch einen Verlust an Agrin-stabilisierten Azetylcholin-Rezeptor-Clustern verursacht sein könnte. Dies führte zu der Hypothese, dass TGF-β2 an der neuromuskulären Endplatte als Ko-Faktor für Agrin die Nerv-Muskel-Interaktion modulieren könnte. Die TGF β2-defizienten Embryonen wiesen eine ausgeprägte Disorganisation des Zwerchfellmuskels und eine gestörte Differenzierung der Muskelzellen auf. Dies bestätigte die Annahme, dass TGF-β2 an der Differenzierung von Myoblasten beteiligt ist.
In einer elektrophysiologischen Untersuchung des Prä-Bötzinger-Komplexes, der Teil des respiratorischen Systems der ventralen Medulla ist, wurde in TGF-β2-defizienten Embryonen eine signifikant erniedrigte Netzwerk-Aktivität festgestellt. Diese konnte auf eine verminderte glutamaterge und GABAerge/glyzinerge Transmission zurückgeführt werden. Gleichzeitig ist durch diese Beobachtung der Verlust der Atemtätigkeit der TGF-β2-defizienten Tiere zu erklären, die in dieser Arbeit ebenfalls belegt wurde und die wahrscheinlich zur kongenitalen Zyanose der Tiere führt. Der verminderten synaptischen Transmission lag keine verminderte Anzahl von Synapsen und damit wahrscheinlich kein Defekt in der Synaptogenese zugrunde. Es wurde deshalb geprüft, ob die verminderte Transmission durch eine beeinträchtigte synaptische Funktion wie zum Beispiel eine veränderte Mobilität der Neurotransmitter-Vesikel verursacht werden könnte. In hippokampalen Neuronen wurde daher der Einfluss von TGF-β auf die Phosphorylierung von Synapsin untersucht, da diese zu einer Umverteilung der Vesikel in den synaptischen Terminalien beiträgt. Es konnte eine erhöhte Phosphorylierung verschiedener Synapsin-Isoformen nach akuter Behandlung mit TGF-β und eine Hypophosphorylierung nach Blockierung des TGF-β-Rezeptor Typ I demonstriert werden.
Agrin und Aquaporin-4: Einblicke in die Entstehung von Hirnödemen
Die Entstehung vasogener Ödeme als Folge des Integritätsverlustes der Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eines der größten klinischen Probleme sowohl bei chemisch-physikalischen Traumata als auch bei Tumoren des zentralen Nervensystems. Verantwortlich für diese Störung des Flüssigkeitsaustausches zwischen den einzelnen Gehirnkompartimenten zeigt sich das Wasserkanalprotein Aquaporin-4 (AQP4), welches als bisher einzig bekannter Bestandteil der sogenannten orthogonalen Partikelkomplexe (OPK) in den perivaskulären Endfüßen der Astrozyten geklustert wird. Diese Partikelkomplexe werden ausschließlich konzentriert in Membranbereichen exprimiert, in welchen der Astrozyt mit dem Mesenchym in Kontakt tritt, wie dies perivaskulär oder an der Gehirnoberfläche in Form der Glia limitans superficialis et pericvascularis der Fall ist. Parenchymale Membranbereiche zeigen immunzytochemisch kein AQP4-spezifisches Signal.
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In einer Arbeit wurde die Expression von AQP4 im humanen Glioblastom untersucht und mit dem Expressionsmuster des extrazellulären Matrix-Heparansulfat-Proteoglykans Agrin sowie Bestandteilen des Dystrophin-Dystroglykan-Komplexes (DDC), welcher den Wasserkanal über eine PDZ-Domäne in der Zellmembran verankert, korreliert. Zu Kontroll- und Vergleichszwecken wurde jeweils Gehirngewebe von gesunden Ratten mituntersucht. Nach Visualisierung der immunhistochemischen Markierungen mittels Laser-Scan-Mikroskopie zeigte sich, dass das polare Expressionsmuster von AQP4 und seines Ankermoleküls α1-Syntrophin im Gliomgewebe verloren geht und beide Moleküle über alle astrozytären Membranoberflächen verteilt nachweisbar sind. Dieser Befund korrelierte positiv mit dem Verlust bzw. einer endothelial orientierten Lokalisation von Agrin in der perivaskulären extrazellulären Matrix. Ebenso konnte eine verminderte bis fehlende Expression des glialen α-Dystroglykans, des Rezeptormoleküls für Agrin, dargestellt werden. Interessanterweise war andererseits eine starke Immunreaktivität gegenüber α-Dystroglykan im Gefäßendothel nachweisbar. Die Expression der Hauptkomponenten des DDC, Dystrophin und Utrophin, blieb trotz des Polaritätsverlustes bzw. der Umverteilung von AQP4 und α1-Syntrophin über die gesamte Zellmembran ausschließlich auf die Astrozytenendfüße beschränkt.
Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass im Glioblastom eine räumliche Dissoziation von AQP4 und α1-Syntrophin vom DDC stattfindet und sich in der Folge beide Moleküle in unpolarisierter Form über die gesamte Zellmembran verteilen. Da die Dissoziation der beiden Moleküle jedoch positiv mit dem Verlust von Agrin in der extrazellulären Matrix korreliert, wird mit den vorliegenden Ergebnissen stark die Hypothese unterstützt, dass Agrin über die Bindung an α-Dystroglykan direkt für die Klusterung von AQP4 bzw. möglicherweise des gesamten DDC in Form der OPKs verantwortlich ist.
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