Die Entschlüsselung der komplexen Architektur des Gehirns, bestehend aus Milliarden dicht gepackter Neuronen mit tausenden von Synapsen, stellt nach wie vor eine immense Herausforderung dar. Fortschritte in der Mikroskopie, insbesondere in der Lichtmikroskopie, ermöglichen jedoch zunehmend detailliertere Einblicke in die neuronale Struktur und Konnektivität.
LICONN: Ein Durchbruch in der lichtmikroskopiebasierten Konnektomik
Am Institute of Science and Technology Austria (ISTA) wurde eine neue Mikroskopie-Pipeline namens LICONN (light-microscopy-based connectomics) entwickelt, die einen bedeutenden Durchbruch darstellt. LICONN ist die erste Technologie jenseits der Elektronenmikroskopie, die in der Lage ist, Gehirngewebe mit allen synaptischen Verbindungen zwischen Neuronen zu rekonstruieren. Diese von Mojtaba R. Tavakoli, Julia Lyudchik, Johann Danzl und ihren Kollegen entwickelte Technik ermöglicht es, die komplexen Netzwerke des Gehirns zusammenzusetzen, indem sie feinste neuronale Prozesse zusammenfügt und jede synaptische Verbindung korrekt mit dem entsprechenden Neuron verknüpft.
„Bislang war das mit keiner Lichtmikroskopietechnik möglich“, sagt Johann Danzl. „Es war ein langjähriges Ziel unserer Gruppe, eine solche Pipeline für die Rekonstruktion von Hirngewebe zu entwickeln. Und LICONN schafft das, während es bestimmte Moleküle in den Kontext der strukturellen Rekonstruktion einordnet.“
Ein besonderer Vorteil von LICONN ist die Verwendung eines handelsüblichen Standardmikroskops für die Bildaufnahme, was die Technik schnell und für Mehrfarbenaufnahmen geeignet macht. Da keine hochmodernen, teuren Geräte erforderlich sind, kann die Technik weltweit reproduziert werden.
Funktionsweise von LICONN: Hydrogel-Expansion und Deep Learning
Um den erforderlichen Detailgrad zu erreichen, nutzt LICONN die chemischen und physikalischen Eigenschaften von Hydrogel, einem dreidimensionalen Polymernetzwerk, das Wasser aufnehmen und kontrolliert aufquellen kann. Das zu untersuchende Hirngewebe wird in dieses Hydrogel eingebettet, wodurch sich die Zellbestandteile mit dem Hydrogel verbinden und die feine Ultrastruktur der Zellen auf das Gel übertragen und für die Mikroskopie erhalten bleibt.
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Vor der Bildgebung werden die Strukturen erweitert, indem dem Material Wasser zugeführt wird. Dadurch dehnt sich das Gel in alle Richtungen aus, wobei die relative Anordnung der Gewebestrukturen mit extrem hoher Genauigkeit erhalten bleibt. Im Vergleich dazu sind herkömmliche Lichtmikroskope in ihrer Auflösung auf etwa 250 bis 300 Nanometer begrenzt, was für die Rekonstruktion von dicht gepacktem Hirngewebe nicht ausreicht.
„Durch die Expansion des Hydrogels werden die Strukturen des Hirngewebes so weit auseinandergezogen, dass wir sie mit einem Standard-Lichtmikroskop auflösen können. Diese Methode erhöht die effektive Auflösung um das 16-fache und erreicht eine Auflösung von besser als zwanzig Nanometern“, erklärt Tavakoli.
Methoden aus der Informatik spielen ebenfalls eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung der Pipeline. Die Aufnahme mikroskopischer Bilder führt zur Erfassung zahlreicher Datenpunkte, deren Komplexität die Komplexität des Gehirns widerspiegelt. Um die Interpretation und Rekonstruktion aller neuronalen Strukturen in großem Maßstab zu automatisieren, wurden Deep-Learning-Tools von Google Research darauf trainiert, die einzelnen Zellen im Gewebe zu segmentieren.
„Durch die Automatisierung der Identifizierung von Neuronen und ihrer komplexen Strukturen in größerem Maßstab mithilfe künstlicher Intelligenz wurde die gewaltige Aufgabe, alle zellulären Komponenten zu rekonstruieren, praktisch beherrschbar“, erklärt Viren Jain von Google Research. „Die Möglichkeit, gleichzeitig bestimmte Moleküle zu visualisieren, liefert eine neue Dimension an Informationen.“
Die außergewöhnlich hohe Auflösung der Daten ermöglicht es, die synaptischen Verbindungen zwischen Neuronen automatisch zu erkennen und die Roh-Bilddaten des Gehirns in detaillierte Konnektivitäts-Karten umzuwandeln.
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Anwendung von LICONN: Visualisierung molekularer Mechanismen
LICONN ermöglicht es, die Position bestimmter Moleküle auf den neuronalen Rekonstruktionen abzubilden, beispielsweise solche, die an der Signalübertragung zwischen Neuronen an Synapsen beteiligt sind. Mithilfe dieses umfassenden Verfahrens können Forschende Gehirngewebe akribisch rekonstruieren und neuronale Verbindungen und Netzwerke visualisieren. Das Zusammenspiel zwischen Experimenten und Analysen verschiedener Disziplinen führt zu 3D-Visualisierungen der Gehirnarchitektur auf einem neuen Komplexitätsniveau.
Miniatur-Mikroskop für frei bewegliche Tiere
Forschende des Max-Planck-Instituts für Neurobiologie des Verhaltens - caesar haben ein Miniatur-Mikroskop entwickelt, das Mäuse auf dem Kopf tragen können, während sie sich uneingeschränkt bewegen. Das nur zwei Gramm schwere ferngesteuerte Mikroskop kann die neuronale Aktivität in allen Schichten der Großhirnrinde messen, selbst in tiefliegenden, ohne dass das Tier während der Versuche gestört wird. Anders als alle vergleichbaren Modelle funktioniert es auch bei Helligkeit und ermöglicht daher die Untersuchung des gesamten Verhaltensspektrums.
„Wir wollen herausfinden, wie Tiere ihren Sehsinn nutzen, um Entscheidungen zu treffen. Viele der Nervenzellen, die vermutlich in diese Prozesse involviert sind, liegen tief im sogenannten visuellen Cortex, einem Teil der Großhirnrinde. Um diese Nervenzellen zu erreichen, haben wir ein extrem leichtes, kopfgetragenes Mikroskop entwickelt. Mit diesem gelingt es uns, die Aktivität der betreffenden Nervenzellen zu messen, ohne das Tier dabei in seinem Verhalten zu stören. Dies ist ein enormer Schritt, um die Gehirnaktivität tief in der Großhirnrinde zu analysieren, während das Tier natürliches, visuell gesteuertes Verhalten zeigt“, sagt Jason Kerr, Leiter der Abteilung Organisation des Gehirns und Verhaltens.
Das neue Drei-Photonen-Miniaturmikroskop bietet eine Reihe von Innovationen. Erstmalig ist es nun möglich, neuronale Aktivität in Einzelzellauflösung in allen Schichten der Großhirnrinde zu erfassen. Da das Fokussieren ferngesteuert erfolgt, wird das Tier während der Messungen nicht in seinem Verhalten beeinträchtigt. Das modulare Design des Mikroskops bietet zudem eine Einstellung für funktionelle, hochaufgelöste Bildgebung von neuronalen Zellkörpern bis hin zu den Ausläufern, den Dendriten. Aufgrund eines modifizierten Detektorsystems kann das Mikroskop auch in beleuchteter Umgebung verwendet werden.
Unterschiede in der neuronalen Kommunikation zwischen Mensch und Maus
Eine Studie der Charité - Universitätsmedizin Berlin hat ergeben, dass die Neurone beim Menschen in eine Richtung kommunizieren, während die Signale bei der Maus häufiger in Schleifen fließen. Dies macht die Informationsverarbeitung beim Menschen leistungsfähiger und effizienter.
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„Unser bisheriges Verständnis der neuronalen Architektur in der Großhirnrinde basiert größtenteils auf Erkenntnissen, die an Tiermodellen wie der Maus gewonnen wurden“, erklärt Prof. Jörg Geiger, Direktor des Instituts für Neurophysiologie der Charité. „Bei ihnen kommunizieren die benachbarten Nervenzellen häufig wie in einem wechselseitigen Dialog miteinander, ein Neuron funkt ein anderes an und dieses sendet wieder ein Signal zurück. Die menschliche Großhirnrinde ist deutlich größer und auch komplexer als bei der Maus. Trotzdem hat man bisher - auch aufgrund fehlender Daten - angenommen, dass sie nach denselben Verschaltungsprinzipien funktioniert.
Für die Studie untersuchten die Forschenden Hirngewebe von 23 Menschen, die sich aufgrund einer Epilepsie einer neurochirurgischen Operation an der Charité unterzogen hatten. Um die Signalflüsse zwischen benachbarten Neuronen in der äußersten Schicht der menschlichen Großhirnrinde beobachten zu können, entwickelte das Team eine verbesserte Variante der sogenannten Multipatch-Technik. Sie erlaubte den Forschenden, der Kommunikation von bis zu zehn Nervenzellen gleichzeitig zu lauschen.
Das Ergebnis: Nur ein kleiner Bruchteil der Neurone führte wechselseitige Dialoge. „Beim Menschen fließen die Informationen stattdessen vorrangig in eine Richtung, sie kehren nur selten direkt oder über Schleifen an den Ausgangspunkt zurück“, erklärt Dr. Yangfan Peng, Erstautor der Publikation.
Die Forschenden gaben dem künstlichen neuronalen Netzwerk eine typische Aufgabe des maschinellen Lernens: Es sollte Audio-Aufnahmen von Zahlwörtern erkennen und ihnen die richtige Ziffer zuweisen. Es zeigte sich, dass das dem Menschen nachempfundene Modell bei dieser Spracherkennung häufiger richtig lag als ein der Maus nachempfundenes.
„Die gerichtete Netzwerk-Architektur beim Menschen ist leistungsfähiger und ressourcenschonender, weil mehr unabhängige Nervenzellen gleichzeitig unterschiedliche Aufgaben bewältigen können“, erklärt Yangfan Peng. „Das Netzwerk kann also mehr Informationen speichern.
Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie für kleinste Zellstrukturen
Forscherinnen und Forscher der Universität Göttingen haben ein neues Fluoreszenzmikroskop entwickelt, das dank einer Auflösung von besser als fünf Nanometern selbst kleinste Zellstrukturen erfasst. Grundlage dieser Technik ist die sogenannte Einzel-Molekül-Lokalisierungs-Mikroskopie, bei der einzelne aufleuchtende Moleküle in einer Probe ein- und ausgeschaltet und dann deren Positionen einzeln sehr präzise bestimmt werden.
„Diese neu entwickelte Technik ist ein Meilenstein im Feld der hochauflösenden Mikroskopie. Sie bietet nicht nur Auflösungen im einstelligen Nanometerbereich, sondern ist im Vergleich zu anderen Methoden besonders kostengünstig und einfach zu handhaben“, so Enderlein.
Aufklärung des Mechanismus der Synapsenentstehung
Forschende vom Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie (FMP) haben zusammen mit einem internationalen Team einen entscheidenden Mechanismus aufgedeckt, der die Entstehung von Synapsen ermöglicht. Die Erkenntnisse liefern wichtige Grundlagen, um künftig die Regeneration von Nervenzellen zu befördern oder auch Alterungsprozessen entgegenzuwirken.
Synapsen stellen Kontaktstellen zwischen axonalen Nervenendigungen (die Präsynapse) und postsynaptischen Neuronen dar. An diesen Synapsen wird das elektrische Signal in chemische Botenstoffe umgewandelt, die dann von den Postsynapsen anderer Nervenzellen empfangen werden.
Um die Entstehung von Präsynapsen von Anfang an nachverfolgen zu können, haben die Forschenden in humanen Stammzellen per Genschere CRISPR ein leuchtendes Protein eingebaut und aus den so modifizierten Stammzellen Nervenzellen generiert.
Die Forschenden konnten darlegen, dass für den axonalen Transport eine Maschinerie aus Motorproteinen angeworfen wird. Der Haupttreiber ist demnach das sogenannte Kinesin „KIF1A“. Dieses Motorprotein ist vor allem im Zusammenhang mit neurologischen Störungen im peripheren Nervensystem und im Gehirn bekannt.
„Wir vermuten, dass Mutationen in KIF1A den axonalen Transport präsynaptischer Proteine behindern und es so zu neurologischen Symptomen wie Bewegungsstörungen, Ataxie oder geistigen Behinderungen kommt", erläutert Volker Haucke.
Die Forschenden bestimmten auch die zellbiologische Identität des eigentlichen Transportmittels. Während die allermeisten sekretorischen Vesikel aus dem sogenannten Golgi-Apparat stammen, haben diese axonalen Transportvesikel keine Golgi-Markierung, sondern teilen sich Markierungen mit dem endolysosomalen System, das in anderen Zellen den Abbau von defekten Proteinen bewirkt.
„Unsere Arbeit legt nahe, dass Neuronen eine Art neue Organelle erfunden haben, eine Transportorganelle, die es wahrscheinlich in dieser Form nur in Nervenzellen gibt“, erläutert Dr. Sila Rizalar, FMP-Postdoc und Erstautorin der in „Science“ publizierten Arbeit.
Lichtscheibenmikroskopie zur Visualisierung von Synapsen in Gewebeproben
Um Synapsen sichtbar zu machen, entwickelte das Forscherteam an der Southwestern University Texas unter der Leitung von Reto Fiolka und Kevin Dean ein spezielles Mikroskop. Mit ihm beleuchten sie eine etwa millimetergroße Gewebeprobe von der Seite mit keilförmig fokussiertem Licht. Während sich der Fokus dieses Licht-Keils verschiebt, werden Bilddaten aufgenommen. So gelingt es den Forschenden, mithilfe von maschinellem Lernen hochaufgelöst und maßstabsgetreu dreidimensionale Gewebestrukturen innerhalb der Zellen zu erkennen und sichtbar zu machen.
Mit bis zu 260 nm ist die axiale Auflösung des Mikroskops je nach optischer Konfiguration drei- bis zehnmal höher als bei konfokalen und bisherigen Lichtscheiben-Mikroskopen.
Neuronale Vielfalt: Unterschiedliche Zelltypen im Nervensystem
Die im Nervensystem anzutreffenden Neuronen können sich auf mehrere Weise im Aufbau unterscheiden. Es gibt verschiedene Zelltypen, die sich in der Anzahl und Anordnung ihrer Fortsätze unterscheiden:
- Unipolare Nervenzellen: Besitzen nur eine einzige Nervenfaser, die gleichzeitig als Dendrit und Axon agiert.
- Bipolare Nervenzellen: Besitzen zwei Fortsätze, einen Dendriten und ein Axon, die an den gegenüberliegenden Polen des Somas ausgebildet sind.
- Multipolare Nervenzellen: Besitzen zahlreiche Dendriten und ein Axon.
- Pseudounipolare Nervenzellen: Besitzen einen Nervenzellfortsatz, der sich in der Nähe des Somas T- oder Y-förmig in einen zentralen (ursprünglich Axon) und einen peripheren Fortsatz (ursprünglich Dendrit) aufspaltet.
Eine weitere Unterscheidungsmöglichkeit ist die Ausprägung der Myelinscheide durch Schwannsche Zellen im Axonbereich. Es existiert hierbei sowohl eine markhaltige als auch eine marklose Form. Nervenfasern werden als markhaltig bezeichnet, wenn deren Axone mit einer starken Myelinscheide umhüllt sind.
Historischer Kontext: Pioniere der Neuroanatomie
Für die Verbindungen zwischen den Zellen des Nervensystems interessierten sich bereits vor 140 Jahren Anatomen wie Santiago Ramon y Cayal und Camillo Golgi. Erst raffinierte Färbetechniken ermöglichten es, den Verlauf und die Verbindungen einzelner Neurone nachzuzeichnen. Die Darstellung von Details war erst nach Erfindung des Elektronenmikroskops möglich.
Cayal sollte mit seiner Postulierung, dass es zwar Kontaktstellen gäbe, diese aber nicht beständig seien und nur bei der Kommunikation genutzt würden, recht behalten. Sehen konnte man dies damals allerdings nicht, da die Auflösung der Lichtmikroskope dafür nicht ausreichte. So erhielten beide Konkurrenten 1906 gemeinsam den Nobelpreis für Medizin „in Anerkennung ihrer Arbeit über die Struktur des Nervensystems“.
Konnektomik: Die Kartierung des Gehirns
Das Forschungsgebiet der Konnektomik hat nicht nur zahlreiche Tüftler und Erfinder zu bieten, sondern auch wahre Kunstwerke hervorgebracht. In der Neuzeit verblüffte insbesondere Jeff W. Lichtman seine Kollegen mit der „Brainbow“-Technik, die er an der Harvard University entwickelt hat. Ähnlich wie bei einem Kabelstrang die einzelnen Leitungen mit verschiedenen Farben gekennzeichnet sind, ist dies Lichtman mit einzelnen Neuronen gelungen. In bis zu 100 verschiedenen Farbnuancen leuchten die nunmehr klar unterscheidbaren Neuronen schließlich unter dem Mikroskop, wenn Wissenschaftler schließlich die Hirnschnitte mit Fluoreszenzlicht bestrahlen - ein Anblick, der sicher auch Pioniere der Neuroanatomie wie Santiago Ramón y Cayal begeistert hätte.
Fortschritte in der Mikroskopie: Von Tracer-Techniken bis zur Lichtscheibenmikroskopie
Lange Zeit jedoch blieb das Gewirr der Nervenzellfortsätze (Neuropil) für Neuroanatomen und Histologen undurchdringlicher als jeder Dschungel. Gesucht wurde eine Methode, um einzelne Nervenzellfortsätze oder ganze Nervenstränge zu verfolgen. Die kam in den späten 1960er Jahren, als Zellbiologen mit radioaktiv markierten Aminosäuren arbeiteten, die sie in die Zellkörper von Neuronen injizierten.
Auch der Gegenverkehr - also der retrograde axonale Transport - lässt sich verfolgen. Dazu wird das Enzym Meerrettich-Peroxidase ins Gehirn gespritzt, wo es von den Enden der Axone aufgenommen und zum Zellkörper transportiert wird. Später wird das Versuchstier geopfert, und die Meerrettich-Peroxidase in den Gewebeschnitten bildet unter Zugabe bestimmter Chemikalien bunt-farbige Reaktionsprodukte. So wird unter dem Mikroskop schließlich der Verlauf der Fasern durch das Gehirn und ein möglicher Zusammenhang einzelner Neurone sichtbar.
Auch Herpesviren können - beispielsweise an Mund und Lippen - in Axone eindringen und wandern von dort zum Zellkörper. In Tierversuchen lassen sich bestimmte Stämme in ausgewählte Hirnregionen spritzen. Deren Wanderung durch benachbarte Neurone können Forscher dann nach einigen Tagen mit Hilfe von Antikörpern sichtbar machen .
Auch die Lichtmikroskopie ist beim Konnektom-Projekt mit an Bord. Hier wurden ebenfalls technische Verbesserungen mit neuen Methoden kombiniert, um tiefer ins Gewebe einzudringen, Unschärfen zu eliminieren und die Auflösung zu verbessern. So liefert die Lichtscheibenmikroskopie eine Auflösung von 100-300 Nanometern. In Kombination mit den Klarifizierungstechniken, die dem Gewebe Lipide entziehen, um es durchsichtiger zu machen, reicht das aus, um nicht nur Zellen und Neurone zu erfassen, sondern sogar einzelne Synapsen.
SCAPE: Ein neuartiges Mikroskop für 3D-Filme von lebenden Proben
Für 3D-Filme von sich bewegenden Proben haben Wissenschaftler der Columbia University in New York ein weiteres, neuartiges Mikroskop - SCAPE genannt - entwickelt.
„Mit SCAPE können wir nun komplexe, lebende Objekte wie etwa feuernde Neuronen im Hirn von Versuchstieren beobachten“, sagt Elizabeth Hillman vom Columbia University Medical Center. Das sei bisher nicht möglich gewesen.
Um in schneller Bildfolge dreidimensionale Mikroskopbilder zu erhalten, verwendeten Hillman und Kollegen einen Polygonspiegel mit mehreren zueinander versetzten Spiegelflächen. Dieses Spiegelpolygon schwenkten sie zehn bis 40 Mal pro Sekunde hin und her und konnten so in schneller Folge ein Objekt in mehreren Belichtungsebenen erfassen.
Herausforderungen und Zukunftsperspektiven der Konnektomik
Nach Schätzungen liefert bereits ein Kubikmillimeter Hirngewebe eine Informationsmenge von mehreren Petabytes, also etwa das Tausendfache des Speichers eines modernen Heimcomputers. Dies zu verarbeiten, erfordert nicht nur Rechner mit entsprechend gewaltiger Geschwindigkeit und Speicherkapazität, sondern auch spezielle Programme, deren Algorithmen sowohl Muster in der Datenflut erkennen können, als auch diese Daten in anschaulicher Form darstellen.
Liegen die Daten erst einmal auf dem Computer, gilt es, diese auch richtig zu interpretieren. Hier kommen Forscher wie Winfried Denk ins Spiel, der mit seinen Kollegen am Max-Planck-Institut für Biomedizinische Forschung in Heidelberg eine Methode ersonnen hat, um miteinander verbundene Neurone zu erkennen und zu markieren. Und im Labor von Sebastian Seung am Massachussetts Institute of Technology haben die beiden Studenten Viren Jain und Srini Turaga ein Programm auf Basis der künstlichen Intelligenz (KI) geschrieben, das lernen kann, Synapsen zu erkennen, wenn es die Neurowissenschaftler eine Zeitlang bei der Arbeit verfolgt.